JCI insight丨STAT3/SETDB2 轴决定着伤口修复过程中巨噬细胞中NF-κB 介导的炎症反应

SETDB2在NF-κB依赖性基因启动子中富集于小鼠伤口巨噬细胞中

    在人类和鼠类伤口巨噬细胞中，SETDB2富集在NF-κB依赖性基因启动子上。为了研究 SETDB2 在伤口巨噬细胞中控制的下游基因，并阐明 SETDB2 控制巨噬细胞表型的确切转录靶标、 作者对来自Setdb2fl/fl Lyz2Cre+ mTmG小鼠伤口的CD3-CD19-Ly6G- CD11b+Ly6Chi GFP+和CD3-CD19-Ly6G- CD11b+Ly6Clo GFP+细胞进行了 FACS 检测。 在这一系统中，成功的基因重组会同时导致Tomato报告子的切除和 GFP 报告子的激活，从而在成功进行 Cre 介导的缺失基因删除的细胞中实现 GFP 表达。鉴于作者之前发现SETDB2在伤口后第 5 天的伤口巨噬细胞中表现出最高的表达量，作者从Setdb2fl/flLyz2Cre mTmG小鼠中分离了第 5 天的伤口巨噬细胞，以确定SETDB2缺失后巨噬细胞下游转录特征的最大改变。由于 Ly6C 是一种公认的指定炎性巨噬细胞亚群的表面标记物，作者进一步使用 FACS 将CD3-CD19-Ly6G- CD11b+ GFP+群体分离成CD3-CD19-Ly6G- CD11b+ GFP+Ly6Chi（Ly6Chi）和CD3-CD19-Ly6G- CD11b+ GFP+Ly6Clo（Ly6Clo）亚群，以根据炎性亚型划分转录差异。作者对Ly6Chi和Ly6Clo亚群进行了 RNA-Seq 分析，确定了这些亚型的基因表达谱，并研究了 SETDB2 如何影响这些亚群的基因表达。不出所料，作者观察到Ly6Chi和Ly6Clo 之间差异表达基因的显著差异，而 SETDB2 的缺乏又进一步改变了这些基因的表达（图 1A）。此外，作者发现 SETDB2 控制着在伤口修复中起关键作用的炎症基因的表达，包括Il1b、Il6、Il12 和Tnf，而 SETDB2 缺失会进一步增加Ly6Chi群体中这些基因的表达（图 1，B 和 C）。重要的是，发现的许多 DEGs 都是众所周知的 TNF-α 和 IFN-β 信号通路的下游靶点，它们在包括伤口愈合在内的重要生物过程中调节炎症起着关键作用。为支持 SETDB2 调节炎症表型，这些促炎症基因在 Ly6Chi 巨噬细胞群中更为富集，与Ly6Clo巨噬细胞亚型相比，Ly6Chi巨噬细胞群显示出更强的炎症特征。为了进一步划分 SETDB2 调控的下游通路，作者对 DEGs 进行了基因本体（GO）分析，结果支持伤口巨噬细胞中Ly6Chi和Ly6Clo亚群之间独特的转录特征（图 1D）。此外，在 Setdb2 缺陷的Ly6Chi巨噬细胞中，包括免疫反应、对 LPS 的反应和细胞因子活性在内的通路也被上调，这进一步支持了 SETDB2 在限制该亚群炎症表型中的作用。此外，Setdb2缺陷型Ly6Chi巨噬细胞亚群的通路分析表明，IL-1R和NF-κB信号的激活增加，进一步支持了SETDB2在负向调节这些炎症通路中的作用。由于基因表达的变化不一定反映 SETDB2 缺失导致的染色质结构的改变，作者接下来对从Setdb2fl/fl Lyz2Cre+和 Cre 阴性对照的伤口中 FACS 分离出的CD3-CD19-Ly6G- CD11b+ Ly6C+ GFP+细胞进行了 ATAC-Seq，以检测 Setdb2 缺陷伤口巨噬细胞中染色质的可及性，并特别关注图 1A 中 RNA-Seq 鉴定出的炎症相关基因。作者的 ATAC-Seq 分析发现，与 Setdb2 基因健全的Ly6Chi细胞相比，Setdb2 基因缺陷的Ly6Chi伤口巨噬细胞中炎症基因（Il1b 、Nfkb1 、Relb 、Rel 、Cxcl2）的染色质可及性增加了（图 1E）。这些最初的无偏测序结果还有两个值得注意的发现。首先，正如之前所显示的，SETDB2 通过 H3K9 的三甲基化促进封闭染色质构型，从而导致炎症基因的沉默。其次，SETDB2调节炎症基因启动子中NF-κB结合区染色质的可及性，这再次证实了之前的研究结果，即SETDB2转录靶向NF-κB结合启动子区。由于作者发现 SETDB2 能特异性地调节炎症基因启动子区中的 NF-κB 结合区，因此作者试图更具体地研究 SETDB2 和 NF-κB 在已知的 NF-κB 靶基因上的相互作用。作者分离了小鼠生化巨噬细胞（BMDMs），并用 IFN-β（10 U/mL；8.5 ng/mL）（作者之前已确定 IFN-β是 SETDB2 的强效上游调节因子）处理，同时使用或不使用 NF-κB 抑制剂（BAY 11-7082，10 μM）。然后，对炎症基因启动子上由 SETDB2 沉积的抑制性表观遗传标记 H3K9me3 进行了 ChIP 分析。IFN-β 导致Il1b和Tnf启动子上的 H3K9me3 预期增加，而这种 H3K9 三甲基化在 NF-κB 抑制剂的处理下被逆转（图 1，F 和 G）。总之，这些数据表明，SETDB2 通过调节这些基因内染色质的可及性，抑制 NF-κB 依赖性炎症基因的表达，而矛盾的是，NF-κB 在这些基因启动子上正向调节 SETDB2 的功能。

STAT3 在人类和鼠类伤口巨噬细胞的伤口修复过程中是动态的，并调节SETDB2

    STAT3 可调控人和小鼠伤口巨噬细胞中 SETDB2 的表达，并且是正常伤口愈合所必需的。作者研究了调控巨噬细胞中SETDB2表达的上游转录机制。作者采用了生物信息学、体外和体内相结合的方法来确定调控SETDB2 表达的 TFs。由于作者的研究小组之前已经发现 STAT 蛋白能调控SETDB2的表达，因此作者分析了人类SETDB2启动子中预测的 STAT 结合位点。利用可公开访问的 TF 结合数据库 JASPAR，作者检查了各种 STAT 蛋白结合位点，发现 STAT3 是预测与SETDB2启动子结合的最主要 STAT TF。作者在人类SETDB2启动子中发现了 24 个推定的 STAT3 结合位点，这些位点还与活跃转录的多个特征重叠，包括 H3K27Ac、H3K4me3 和开放染色质 DNase 超敏位点（DHS），这些位点都是通过 UCSC 基因组浏览器（https://genome.ucsc.edu/ ）发现的（图 2A ）。虽然作者之前已经确定了 STAT1 在调控巨噬细胞中SETDB2的重要性，但根据作者最近对人类伤口的 scRNA-Seq 数据以及对 TF 与SETDB2启动子结合的分析，作者确定 STAT3 是伤口巨噬细胞中表达最强烈、最丰富的 STAT 成员（图 2B）。此外，为了进一步研究 STAT3 和 SETDB2 之间的关系，作者对患者皮肤伤口 scRNA 序列中的巨噬细胞进行了皮尔逊相关性分析。作者发现，在人类伤口巨噬细胞中，STAT3和SETDB2表现出显著且非常强的相关性（图 2C）。接下来，为了证实 Stat3 与Setdb2启动子的结合，作者分离了小鼠巨噬细胞并对 Stat3 进行了 ChIP 检测。与IgG对照抗体相比，作者在Setdb2启动子上发现了明显的 Stat3 富集（图 2D）。为了确定 STAT3 功能对SETDB2启动子的影响，作者将人SETDB2转录起始位点的 3 kb 片段克隆到 pGL3 荧光素酶载体中，并测量了它在 BMDMs 中的活性。如图 2E 所示，在用 IFN-β 处理的 BMDMs 中，SETDB2启动子的活性增加了 2 倍，这种增加在用 JAK1/3 抑制剂托法替尼（100 μM）处理后受到抑制。此外，从Stat3fl/fl Lyz2Cre+小鼠和Cre阴性同系对照分离的体内伤口巨噬细胞（CD3-CD19-Ly6G- CD11b+ Ly6C+）显示Setdb2表达减少（图2F），用托法替尼处理BMDMs可减少Setdb2的表达（图2G）。接下来，为了研究 STAT3 在正常伤口愈合过程中的动力学，作者在小鼠伤口愈合后第 0 天和第 5 天采集了伤口巨噬细胞（CD3-CD19-NK1.1-Ly6G- CD11b+ Ly6C+ ），并对 STAT3 进行了 Western 印迹检测。STAT3 从第 0 天到第 5 天明显减少，表明它在整个伤口愈合过程中具有高度动态性（图 2H）。最后，为了测试 STAT3 在伤口修复过程中在巨噬细胞中的作用，作者对Stat3fl/fl Lyz2Cre+和 Cre 阴性对照组进行了创伤，并使用 NIH ImageJ 软件测量了整个愈合过程中的伤口大小。在较早的时间点，髓系细胞特异性地缺失 Stat3 会导致伤口变小；然而，在第 5 天，巨噬细胞中 Stat3 的缺失会导致伤口略微变大，这表明 Stat3 在伤口修复过程中以时间依赖性的方式调节巨噬细胞的表型（图 2I）。综上所述，这些结果表明，STAT3 在整个伤口愈合过程中都是动态的，在这一过程中驱动人和小鼠伤口巨噬细胞中SETDB2的表达，并以时间依赖性的方式调节伤口愈合。

STAT3 抑制伤口巨噬细胞中 SETDB2 和 NF-κB 之间的物理相互作用

    STAT3 可抑制伤口巨噬细胞中 SETDB2 与 NF-κB 之间的物理相互作用。由于作者发现 SETDB2 选择性地靶向 NF-κB 结合的启动子区域，而且 NF-κB 是 SETDB2 在炎症基因启动子上的活性所必需的，因此作者研究了 SETDB2 和 NF-κB 之间的蛋白质相互作用。因此，作者从人类伤口的单细胞 RNA-Seq（scRNA-Seq）数据集中对巨噬细胞进行了表达-相互作用分析，以细胞类型特异性的方式鉴定候选的 SETDB2 结合伙伴。作者发现 SETDB2、RELA（NF-κB 成分）（相互作用得分 0.50）和 STAT3（相互作用得分 0.40）之间的相互作用得分最高（图 3A）。为了证实 SETDB2 与这些 TF 中的一个或多个结合，作者使用重组 GST-SETDB2 与 BMDM 裂解物中的纯 GST 阴性对照进行了谷胱甘肽-S 转移酶（GST）下拉检测。作者发现 NF-κB 成分 p65（RELA）和 STAT3 是 SETDB2 的结合伙伴（图 3B）。值得注意的是，相对于它们的输入，RELA 和 STAT3 与 SETDB2 表现出相似的结合强度，这与作者的候选相互作用分析中分别为 0.50 和 0.40 的相互作用评分相一致，进一步支持了作者的发现。

    鉴于 STAT3 和 RELA 之间的相互作用得分相似，且 STAT3 和 RELA 与 GST-SETDB2 的结合比例相等，作者假设 STAT3 可能会改变 RELA 和 SETDB2 的结合。为了验证这一点，作者首先在用 Stat3 抑制剂（隐丹参酮，1 μM）处理的 BMDMs 中进行了 Setdb2 免疫沉淀。Stat3抑制增加了Setdb2与RelA的结合，表明Stat3确实负向调节了Setdb2/RelA的结合（图3C）。此外，作者在缺乏 Stat3 的 BMDMs（Stat3fl/flLyz2Cre+ ）与 Cre 阴性的同卵对照中进行了内源性 Setdb2 和 RelA 的共免疫沉淀。与对照组相比，Stat3缺陷的巨噬细胞中有更多的NF-κB与Setdb2结合，这证实了作者之前的发现，即Stat3干扰了Setdb2/RelA的相互作用。值得注意的是，在同一组实验中，IFN-β导致NF-κB与Setdb2结合的适度增加，这与作者的RNA-Seq和ATAC-Seq发现的Setdb2对NF-κB依赖性启动子的调控以及作者之前发现的Setdb2活性受IFN-β调控的结果是一致的（图3D）。为了检验 Stat3 对巨噬细胞中 Setdb2 和 RelA 结合的影响，作者在Stat3fl/flLyz2Cre+或 Cre 阴性的同种对照 BMDMs 中对 Setdb2 和 RelA 进行了 ChIP 检测，结果发现与Stat3fl/fl Lyz2Cre-巨噬细胞相比，Stat3 缺失的巨噬细胞中 Setdb2 和 NF-κB 在Il1b和Il6启动子处的富集增加了（图 3，E 和 F）。作者在第 5 天分离的体内伤口巨噬细胞（CD3-CD19-NK1.1-Ly6G- CD11b+）中进行了同一组实验，发现在 Stat3 缺失的巨噬细胞中，Setdb2 和 RelA 与Il1b启动子的结合增加。综上所述，这些结果确定了 STAT3 可抑制伤口巨噬细胞中 NF-κB 和 SETDB2 的结合相互作用，因此，STAT3 的水平可能通过直接影响SETDB2的表达以及干扰炎症基因启动子位点的 SETDB2/NF-κB 结合相互作用而对炎症基因表达的精确控制至关重要。

STAT3 和 SETDB2 核心调节伤口巨噬细胞中炎症基因的表达

    STAT3 和 SETDB2 核心调节伤口巨噬细胞中炎性基因的表达。鉴于 STAT3 在调节SETDB2表达和 SETDB2 活性方面的重要作用，作者研究了 STAT3 在伤口愈合过程中的转录靶标。作者选择了伤口愈合后第 5 天的时间点，这与作者之前在Setdb2fl/fl Lyz2Cre小鼠中进行的 RNA-Seq 和 ATAC-Seq 分析类似，以确保 STAT3 和 SETDB2 缺失之间的准确比较。从Stat3fl/fl Lyz2Cre+小鼠和Cre阴性同系对照小鼠中分离出伤口巨噬细胞，然后用FACS对CD3-CD19-Ly6G- CD11b+ Ly6C+进行分选，并将其分离成Ly6Chi和Ly6Clo群。然后，作者对这些伤口巨噬细胞进行了 RNA-Seq 分析，发现在缺乏 Stat3 的伤口巨噬细胞中，包括 IL-17 和 IL-1BR 通路在内的关键炎症基因通路中的基因表达量增加了（图 4A）。此外，与作者在Setdb2fl/fl Lyz2Cre+伤口巨噬细胞中观察到的结果类似（图 1），Stat3 的炎症转录靶标在Ly6Chi巨噬细胞群体中更高，这与该亚群的促炎症巨噬细胞表型一致。为了确定Stat3下游的重要调控通路，作者对Stat3fl/fl Lyz2Cre+伤口巨噬细胞中的DEGs进行了GO分析，发现在Stat3缺陷的巨噬细胞中，参与IFN-β和TNF-α信号通路的基因上调（图4，B和C）。此外，作者还对Setdb2fl/fl Lyz2Cre+巨噬细胞中上调的一组促炎基因进行了定量 PCR（qPCR），从而验证了 RNA-Seq 数据以及 Stat3 和Setdb2之间的核心共轭作用。与对照组相比，作者观察到Stat3fl/fl Lyz2Cre+BMDM 中包括Il1b、Il6 和Il12a在内的炎性细胞因子表达增加（图 4，D-F）。

    根据作者观察到的 SETDB2 和 STAT3 物理相互作用并参与类似炎症基因调控的情况，作者研究了它们是否调控重叠的信号通路。为了解决这个问题，作者进行了与上述类似的 GO 分析，但特别考察了Setdb2fl/fl Lyz2Cre+和Stat3fl/fl Lyz2Cre+伤口巨噬细胞中上调基因的富集情况。作者发现，在 Setdb2 基因缺陷的巨噬细胞中，共有 584 个基因上调（438 个基因下调），而在 Stat3 基因缺陷的巨噬细胞中，共有 551 个基因上调（746 个基因下调）（图 4G）。其中，12个常见基因在Setdb2fl/fl Lyz2Cre+和Stat3fl/fl Lyz2Cre+巨噬细胞中上调，19个常见基因下调。类似的分析表明，29 个基因在Setdb2fl/fl Lyz2Cre+中下调，但在Stat3fl/fl Lyz2Cre+ 中上调，还有 19 个基因在Setdb2fl/fl Lyz2Cre+中上调，但在Stat3fl/fl Lyz2Cre+ 中下调。仅在Ly6Chi群体中，Rasd1和Lyz1在Setdb2fl/fl Lyz2Cre+和Stat3fl/fl Lyz2Cre+两组中均上调（图 4H）。为了进一步证实 Stat3 抑制下游炎症基因表达的发现，作者在小鼠 BMDMs 中用隐丹参酮（1 μM）处理 6 小时，对 Stat3 进行药理学抑制。在 BMDMs 中抑制 Stat3 会导致Il6和Tnf的表达增加（图 4，I 和 J）。综上所述，这些结果表明 SETDB2 和 STAT3 核心调节促炎基因的转录，STAT3/SETDB2 的相互作用对伤口愈合过程中控制炎性巨噬细胞表型至关重要。

糖尿病伤口巨噬细胞向修复表型过渡期间 STAT3 增加

    在向修复表型过渡的过程中，糖尿病伤口巨噬细胞中的 STAT3 会增加。鉴于作者之前的研究发现 SETDB2 在 T2D 伤口巨噬细胞中减少，而作者目前的数据表明 STAT3 对 SETDB2 有新的调控作用，因此作者研究了 STAT3 对 SETDB2 的调控在糖尿病伤口巨噬细胞中是否发生了改变。为了比较健康巨噬细胞和 T2D 巨噬细胞中STAT3的表达，作者分析了从非糖尿病患者和 T2D 患者分离的人类伤口组织中的 scRNA-Seq。作者发现，与对照组相比，来自人类 T2D 伤口的巨噬细胞中STAT3的表达明显增加（图 5A）。为了模拟糖尿病伤口愈合的病理过程，作者通常使用糖尿病诱导肥胖（DIO）小鼠模型，该模型在生理上密切反映了糖尿病前期的状态，作者实验室和其他实验室已经建立了完善的模型来模拟 T2D 对伤口愈合的病理影响。因此，作者分离了 DIO 和正常饮食（ND）小鼠的伤口巨噬细胞，然后用 IFN-β 处理巨噬细胞。与 ND 巨噬细胞相比，DIO 巨噬细胞的Stat3和Nfkb/c-Rel表达增加（图 5，B 和 C）。通过对不同时间点分离自 ND 和 DIO 小鼠的整个伤口和伤口巨噬细胞进行 Western 印迹分析，也在蛋白质水平上验证了这一点。既然作者发现 STAT3 抑制了正常巨噬细胞中 RELA/SETDB2 的相互作用，作者接下来要问的是，糖尿病巨噬细胞中 STAT3 的增加是否会破坏 RELA/SETDB2 的相互作用，从而可能导致 NF-κB 介导的炎症增加，因为 NF-κB 依赖性启动子上的 SETDB2 减少了。为了验证这一点，作者在ND和DIO小鼠受伤后第5天获得的整个伤口裂解物中进行了Stat3与内源性Setdb2的共免疫沉淀。与 ND 伤口相比，作者观察到 DIO 伤口中 Stat3 与 Setdb2 的结合增加了（图 5D）。为了检验Stat3失调的差异是否是由于活化增加所致，作者测量了ND和DIO巨噬细胞中磷酸化的Stat3，因为Stat3是以活性形式磷酸化的。ND 和 DIO BMDMs 的基础 Stat3 磷酸化并无太大差异，这表明 Stat3/RelA 结合的差异很可能是由于Stat3表达的增加，而不是 Stat3 的活化和/或与 Setdb2 的亲和力。最后，为了测试巨噬细胞中的 Stat3 基因缺失是否能改善糖尿病小鼠的伤口愈合，作者对巨噬细胞特异性缺失 Stat3 的 DIO 小鼠（Stat3fl/fl Lyz2Cre+ ）与 Cre 阴性对照组进行了伤口曲线分析。事实上，巨噬细胞中的 Stat3 基因缺失大大改善了 DIO 小鼠的早期伤口愈合（图 5E）。综上所述，这些结果表明，STAT3在人和小鼠糖尿病伤口巨噬细胞中增加，并在糖尿病伤口中与 SETDB2 产生更强的相互作用，而且作者证实，在巨噬细胞中删除 STAT3 可改善体内糖尿病伤口愈合。