创伤精准修复公众号是创伤精准修复课题组（W&H Group）的官方公众号。本课题组以创伤精准修复与临床转化为主要研究方向。
公众号推出的每一篇文章均是由W&H Group成员精选精读，旨在分享传播与创伤修复相关的最新科研成果。
知识点1 — 巯基化透明质酸的优势
透明质酸（HA）是一种天然的多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性。未修饰的透明质酸分子缺乏反应性官能团，限制了其在化学交联和功能化方面的应用。通过引入巯基（-SH）基团，可以使透明质酸在特定条件下发生交联反应，形成稳定的三维网络结构。例如，巯基可以与二硫键（DTT）或双功能化合物反应，形成可降解的交联水凝胶。巯基还具有氧化还原敏感性，当暴露在氧化环境中，巯基可以与氧化剂反应形成二硫键，从而实现可控降解或药物释放的响应性。
知识点2 —胶原纤维取向的极坐标图分析
通过对组织进行天狼星红染色，使用偏振光显微镜在不同角度下对胶原纤维进行拍摄，记录其排列方向。将纤维的排列方向转化为极坐标形式，以展示纤维在0至360°范围内的分布情况。
数据处理：通过图像分析软件测量每根纤维的方向角度，将这些角度值映射到极坐标图上，形成方向频率图。该图可以清晰显示纤维在特定方向上的集中情况，反映纤维的取向一致性。
应用意义：极坐标图能够直观地反映出胶原纤维的排列状态和一致性，集中且有序的取向通常预示着组织有较高的力学性能和良好的愈合质量。
知识点3 — 细胞抗炎实验的原理和应用
1. 实验原理
2. 应用
糖尿病伤口，尤其是糖尿病足溃疡，是糖尿病的常见并发症，因伤口部位高葡萄糖水平和强氧化应激导致的慢性炎症反应，使得愈合过程显著延迟。在这些伤口中，自由基过多生成引发细胞氧化损伤和炎症，同时高氧化水平也会使关键药物失活，使得传统的单一药物治疗效果不佳。
在这项研究中，温州医科大学吴疆教授（通讯作者）与瓯江实验室何华成研究员（通讯作者）团队开发了一种结合抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的水凝胶（bFGF-HSPP-NAC），其中HSPP为透明质酸钠（HA）和PDA-PEG聚合物合成的水凝胶。该系统通过硫醇-二硫键交换反应将两种药物嵌入水凝胶中，使得在高氧化应激环境中，二硫键断裂，逐步释放药物。水凝胶的特点是响应活性氧（ROS）进行分解，先释放NAC以消除自由基，减轻氧化损伤，然后释放bFGF促进组织再生。研究结果表明，这种组合疗法显著提高了表皮重建、胶原沉积、毛囊再生和血管生成的效果。此外，这种水凝胶的逐步药物释放机制适应糖尿病伤口愈合的不同阶段，展示出显著的治疗潜力。该研究通过体外和体内实验表明，这种水凝胶具有自由基清除、抗炎、促进细胞增殖和血管生成的能力。具体来说，NAC的快速释放保护了bFGF不被失活，同时也减少了炎症反应。随后的bFGF释放则加速了伤口区域的细胞迁移和组织修复。
（A）水凝胶的制备示意图，包括巯基化透明质酸（HA-SH）、PDA-PEG、PDA-PEG-bFGF、PDA-PEG-NAC以及bFGF-HSPP-NAC的制备过程。（B）bFGF-HSPP-NAC水凝胶在伤口处受到ROS（活性氧）的刺激，触发水凝胶降解并释放NAC和bFGF。NAC和bFGF的释放顺序和速率受到ROS水平的控制，从而适应不同的愈合阶段需求。（C）这种可注射的ROS响应型bFGF-HSPP-NAC水凝胶，通过逐步释放NAC和bFGF，在糖尿病伤口中发挥清除ROS、促进细胞外基质（ECM）沉积、血管生成和抗炎的作用，有助于伤口愈合。
（A）通过¹H NMR光谱图分析验证PDA和PDA-OH的成功合成。（B）PDA-PEG和PDA-PEG-NAC的¹H NMR光谱，上下两张谱图展示了PDA-PEG和PDA-PEG-NAC的结构特征。通过对比可以看到，在PDA-PEG-NAC光谱中出现了与NAC相关的新峰，这些特征峰验证了NAC成功接枝到PDA-PEG上。（C）PDA-PEG-NAC聚合物（PP-NAC）的紫外-可见光谱（UV-Vis），光谱图对比了透析前后PP-NAC的吸收峰变化。透析前后光谱显示吸收峰减弱，表明透析去除了游离的未结合分子，验证了PP-NAC的纯化效果。（D）bFGF的Western Blot分析，Western Blot结果展示了bFGF和PDA-PEG的结合情况。条带1为纯bFGF，条带2为PDA-PEG，条带3为PP-bFGF加入二硫苏糖醇（DTT）还原后的表现，而条带4为PP-bFGF未还原时的表现。未还原时的PP-bFGF呈现较高分子量的弥散条带，而还原后的PP-bFGF条带靠近bFGF的位置，验证了bFGF通过二硫键成功结合到PDA-PEG上。（E）HSPP水凝胶的制备过程，使用亚甲蓝染色显示了水凝胶的制备过程，从HA-SH和PDA-PEG溶液混合后迅速形成水凝胶的现象。这种染色展示了水凝胶形成的即时性和成型性。（F）HSPP水凝胶的可注射性，展示了HSPP水凝胶的可注射性实验。水凝胶能够通过10号针头注射成特定形状，保持其结构完整性并在玻璃表面形成字母“WZU”，说明该水凝胶在低剪切力下仍能保持形状和可操作性。（G）HSPP水凝胶的柔韧性，通过将水凝胶贴合在手指上展示其柔韧性。水凝胶能够随着手指弯曲而保持紧密贴合，证明其在不同角度下的柔韧性和稳定性。（H）HSPP水凝胶的SEM图像，展示了水凝胶的内部多孔结构，图中清晰可见相互连通的孔隙网络。这种多孔结构有助于细胞的附着和迁移，有利于组织再生和愈合过程。
（A）NAC的释放曲线，展示了bFGF-HSPP-NAC水凝胶在不同溶液环境（pH = 6.5 H2O2、pH = 6.5 PBS、pH = 7.4 H2O2和pH = 7.4 PBS）中的NAC释放情况。结果显示，在高活性氧（H2O2）和低pH条件下，NAC释放更快，表明水凝胶对氧化环境的响应性。（B）bFGF的释放曲线，展示了bFGF在不同溶液中的释放情况。与NAC类似，在高活性氧条件下bFGF的释放更为显著，但释放速率较NAC慢。这种分阶段释放机制可适应伤口愈合的不同阶段需求。（C）不同NAC浓度的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性UV-Vis光谱，不同NAC浓度的水凝胶在450-650 nm范围内的UV-Vis谱用于检测DPPH自由基清除活性。结果显示，NAC含量越高，清除DPPH自由基的能力越强。（D）不同NAC含量的水凝胶DPPH清除活性，统计数据展示了不同NAC含量的水凝胶清除DPPH自由基的活性，进一步验证了NAC含量对抗氧化能力的增强作用。（E）芬顿反应（Fenton）后各组的照片，展示了经过Fenton后不同处理组的外观。未加水凝胶的Fenton反应组显示出显著的颜色变化，而bFGF-HSPP-NAC处理组保持较浅的颜色，表明其对羟基自由基的清除能力。（F）Fenton反应不同时间点的UV-Vis光谱，显示了水凝胶在不同时间点对Fenton反应产生的自由基的清除效果。随时间延长，吸光度降低，表明水凝胶具有持久的抗氧化作用。（G）bFGF-HSPP-NAC水凝胶保护NIH-3T3细胞免受过氧叔丁醇（TBHP）诱导的氧化损伤的模型，该示意图展示了水凝胶通过先释放NAC减少氧化应激，再释放bFGF促进细胞生长的保护机制。（H）TBHP不同浓度对细胞活性的影响，CCK-8实验显示，随着TBHP浓度增加，NIH-3T3细胞活性显著下降，证明TBHP引起的氧化应激会导致细胞死亡。（I）不同NAC浓度对NIH-3T3细胞活性的影响，在24小时培养后，结果显示NAC浓度越高，对细胞的保护作用越强，进一步验证了NAC的抗氧化和细胞保护能力。（J）NAC预处理对TBHP诱导的细胞活性影响，NIH-3T3细胞在加入TBHP之前进行不同浓度的NAC预处理，结果显示NAC预处理能够显著提高细胞对氧化应激的耐受性。（K）不同NAC浓度的bFGF-HSPP-NAC水凝胶抗氧化性荧光图像，PI染色显示不同NAC浓度的水凝胶对细胞抗氧化的保护效果。NAC浓度越高，细胞死亡（红色荧光）越少，进一步验证了水凝胶的抗氧化性能。
（A）死亡细胞数量，统计了不同NAC浓度的bFGF-HSPP-NAC水凝胶对NIH-3T3细胞的保护作用。结果显示，NAC浓度越高，细胞死亡数量显著减少，表明高NAC浓度能够有效减少TBHP诱导的氧化应激下的细胞死亡。（B）DCFH-DA荧光强度，测量了不同NAC浓度水凝胶的DCFH-DA荧光强度，以评估其抗氧化性能。高浓度NAC水凝胶表现出较低的荧光强度，表明其更强的自由基清除能力。（C）细胞荧光图像，展示了NIH-3T3细胞在不同NAC浓度处理2小时后，再经TBHP处理24小时的荧光图像。图像显示，随着NAC浓度增加，绿色荧光（活细胞）增加，而红色荧光（死细胞）减少，进一步验证了NAC对抗氧化应激的保护作用。（D）抗炎保护模型，示意图展示了bFGF-HSPP-NAC水凝胶通过NAC释放降低炎症反应的机制。NIH-3T3细胞在LPS诱导炎症损伤下，先经过NAC处理降低炎症水平，展示了水凝胶的抗炎作用。（E）细胞活性，MTT实验检测了在不同NAC浓度条件下，脂多糖（LPS）处理对细胞活性的影响。结果显示，NAC浓度越高，细胞活性越高，进一步验证了水凝胶的抗炎效果。（F）细胞活性（不同前体浓度的影响），不同前体浓度制备的水凝胶对细胞活性影响的MTT结果显示，水凝胶具有良好的生物相容性，不同浓度对细胞活性影响较小。（G）体外溶血率，通过PBS、HSPP、bFGF-HSPP-NAC和水的对比实验，检测水凝胶的溶血性。结果显示bFGF-HSPP-NAC水凝胶的溶血率较低，表明其生物安全性高。（H）细胞毒性，使用CCK-8实验检测NIH-3T3细胞在与水凝胶共培养24小时后的活性，结果显示bFGF-HSPP-NAC水凝胶的细胞毒性较低，验证了其良好的生物相容性。（I）活/死细胞荧光图像，Calcein-AM/PI染色显示了与水凝胶共培养的细胞的存活情况。绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞，图像结果显示水凝胶对细胞的存活率影响较小，进一步证明了其生物相容性。
（A）水凝胶治疗方案示意图，展示了伤口愈合过程的三个主要阶段，炎症期、增殖期和重塑期。炎症期表现为炎症细胞和高水平活性氧（ROS）的累积。增殖期血管再生和胶原沉积开始，炎症逐渐减少。重塑期上皮化重建、肉芽组织形成和基质重塑进一步推动组织愈合。图中标识了关键细胞和成分（如NAC和bFGF）在不同阶段的作用。（B）伤口区域的照片和示意图，展示了各组在0、3、7、10、14和17天的伤口愈合情况。对照组（Con）、NAC+bFGF组、HSPP组和bFGF-HSPP-NAC组的伤口变化对比显示，bFGF-HSPP-NAC组的愈合效果最好。右侧的示意图用蓝色阴影显示不同时间点的伤口缩小面积，bFGF-HSPP-NAC组的伤口面积减少最显著。（C）伤口愈合率，量化了各组在愈合过程中的伤口愈合率。结果显示，bFGF-HSPP-NAC组在各时间点的愈合率显著高于其他组，表明该水凝胶能够加速糖尿病伤口愈合。（D）体重变化监测，记录了伤口愈合期间实验动物的体重变化。各组体重变化无显著差异，表明水凝胶治疗对小鼠的整体健康状况影响较小，具有良好的生物相容性。
（A）H&E染色图像展示了伤口组织在第7天和第17天的炎症细胞情况（箭头指示位置）。在第7天，Con和NAC+bFGF组的炎症细胞较多，而HSPP组和bFGF-HSPP-NAC组的炎症细胞较少，表明这些水凝胶具有抗炎效果。到第17天，bFGF-HSPP-NAC组的炎症细胞数量进一步减少，伤口组织显示出更好的愈合状态，说明该水凝胶在减轻炎症的同时促进了组织修复。（B）CD86/CD206免疫荧光双染图像，展示了第7天的CD86（红色）和CD206（绿色）的荧光标记结果。CD86标记的是促炎性M1型巨噬细胞，而CD206标记的是抗炎性M2型巨噬细胞。Con中CD86的红色荧光较多，显示出较高的炎症水平。bFGF-HSPP-NAC组中CD206的绿色荧光明显增加，而CD86的红色荧光减少，表明该组在第7天表现出更强的抗炎效果，有更多的M2型巨噬细胞，有利于伤口愈合。这些结果说明，bFGF-HSPP-NAC水凝胶在体内能够显著减轻炎症反应，促进M2型巨噬细胞的增多，从而加速伤口的愈合。
（A）角蛋白染色，展示了在第7天和第17天的伤口组织角蛋白染色图像。角蛋白染色用于评估表皮重建的情况。第7天时，Con和NAC+bFGF组的角蛋白层较少，而HSPP组和bFGF-HSPP-NAC组的角蛋白层更加完整，表明后两组的表皮修复效果较好。到第17天，bFGF-HSPP-NAC组的角蛋白层最为明显，显示出更优的表皮重建效果。（B）Masson染色，展示了伤口组织在第7天和第17天的Masson染色图像（箭头指示位置为毛囊），用于观察胶原沉积和毛囊再生。第7天时，对照组和NAC+bFGF组的胶原沉积较少，而HSPP组和bFGF-HSPP-NAC组的胶原沉积较多。bFGF-HSPP-NAC组在第17天显示出更丰富的胶原沉积和更好的组织结构重建。同时，bFGF-HSPP-NAC组在第17天的毛囊再生数量也明显多于其他组，表明该组在促进毛囊生成方面具有优势。（C）胶原沉积量的定量分析，在第7天和第17天对胶原沉积率进行了定量。结果显示，bFGF-HSPP-NAC组在两个时间点的胶原沉积率都显著高于对照组和其他处理组，进一步证实其在促进胶原沉积方面的效果。（D）毛囊数量的定量分析，第17天时各组的毛囊数量统计结果表明，bFGF-HSPP-NAC组的毛囊数量最多，显示出其在促进毛囊再生和组织重建中的优异性能。
（A）天狼星红染色图像，展示了在第7天和第17天的血管再生情况，图像中标记出了胶原纤维的分布。Con和NAC+bFGF组的胶原纤维分布较少，而HSPP组和bFGF-HSPP-NAC组的胶原纤维分布更为密集，尤其是bFGF-HSPP-NAC组，表明该组在促进血管再生方面效果最佳。（B）Col I/Col III的定量比率，第17天时统计了I型胶原和III型胶原的比率。结果显示，bFGF-HSPP-NAC组的Col I/Col III比率显著高于对照组和其他处理组，表明该水凝胶有助于构建更强的胶原纤维结构，提高伤口的组织强度和质量。（C）胶原纤维取向的极坐标图，第7天和第17天的胶原纤维取向极坐标图显示了不同处理组胶原纤维的取向变化。bFGF-HSPP-NAC组的胶原纤维排列更为有序，表明该组水凝胶促进了纤维取向的重建，有助于增强伤口愈合后的组织结构稳定性。（D）胶原纤维取向的形态学定量分析，通过Image J分析软件，对胶原纤维的取向进行量化。结果显示，在第7天和第17天，bFGF-HSPP-NAC组的胶原纤维排列分布更为集中，具有更强的方向性，进一步验证了其在促进组织再生和结构重建方面的优越性能。
（A）α-SMA/CD31免疫荧光双染图像，展示了第7天时各组在血管再生方面的差异，标记了α-SMA（绿色）和CD31（红色）。α-SMA标记的是平滑肌细胞，CD31标记的是血管内皮细胞，这两个标记的共染显示了新生血管的形成情况。Con和NAC+bFGF组的α-SMA和CD31标记较少，HSPP组和bFGF-HSPP-NAC组的标记较多，尤其是bFGF-HSPP-NAC组，显示出更显著的血管再生效果。（B）bFGF-HSPP-NAC组的放大典型图像，放大了bFGF-HSPP-NAC组中α-SMA和CD31的免疫荧光双染图像。从放大图中可以更清晰地观察到血管结构的形成，显示出平滑肌细胞和内皮细胞之间的整合，表明该水凝胶显著促进了新生血管的成熟和组织化。（C）α-SMA的Western Blot结果，展示了各组中α-SMA的蛋白表达情况。bFGF-HSPP-NAC组的α-SMA表达量明显高于其他组，进一步验证了该组水凝胶在促进血管再生方面的效果。（D）α-SMA/GAPDH的定量比率，第7天时α-SMA与GAPDH的比值定量分析结果。bFGF-HSPP-NAC组的α-SMA/GAPDH比值显著高于对照组，进一步表明该水凝胶具有良好的血管生成促进效果。
综上所述，我们开发了一种用于糖尿病伤口愈合的新型生物响应水凝胶bFGF-HSPP-NAC，该水凝胶通过将bFGF和抗氧化剂NAC结合在聚合物中，在ROS的刺激下逐步释放药物。研究表明，NAC的快速释放能够有效清除自由基，减轻氧化损伤，同时保护bFGF免受ROS的失活。随后，bFGF的持续释放支持了细胞增殖和ECM沉积等过程，有助于伤口修复。该水凝胶在体外和体内实验中展示了其卓越的抗氧化、抗炎以及促进血管生成的效果，从而显著提高了糖尿病伤口的愈合速度。研究表明，这种分阶段释放NAC和bFGF的策略不仅能加速愈合，还能降低炎症反应，具有潜力应用于糖尿病伤口的协同治疗。
上述研究成果在《Journal of Controlled Release》上在线发表，题为“Drug conjugates crosslinked bioresponsive hydrogel for combination therapy of diabetic wound”。温州医科大学助理研究员郑漫辉和温州大学研究生宋文祥、黄培培为论文共同第一作者，温州医科大学吴疆教授和瓯江实验室何华成研究员为论文共同通讯作者。
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