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知识点1 — 溶菌素及噬菌体溶菌素的定义及特性
溶菌素是指由噬菌体（SYL）编码的肽聚糖水解酶，能够直接作用于肽聚糖中的化学键，快速裂解缺少外膜的革兰氏阳性菌的细胞壁。溶菌素具有快速而强的杀菌活性，有助于有效消除生物膜，且产生耐药性的可能性较低，这表明其具有作为抗生素替代品的潜力。
噬菌体溶菌素（LysSYL）是一种针对葡萄球菌种并消除金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物膜的广谱噬菌体溶菌素。它来自于采用富集方法分离得到的针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株XN108的噬菌体，属于Kayvirus属、Herelleviridae科。LysSYL在体内和体外均对葡萄球菌属细菌表现出快速和广谱杀菌活性。它在管理与生物膜形成相关的S. aureus感染方面具有广阔的应用前景。
知识点2 — 不同细菌的差异性
S. aureus：革兰氏阳性菌代表，球形，在培养基中菌落特征表现为圆形，菌落表面光滑，颜色为无色或者金黄色，无扩展生长特点。MRSA是一种对常用抗生素产生耐药性的葡萄球菌感染。
鲍曼不动杆菌（A. baumannii）：常见的革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界的水及土壤中，也存在于正常人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，为条件致病菌。其多为球杆状，两端钝圆，无芽胞，无鞭毛，移动性不高，但生命力极强。它对第三代和第四代头孢菌素的耐药率已达63.0%~89.9%。对四种氨基糖苷类和环丙沙星的耐药率菌达96.3%。
铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）：常见的条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。
大肠杆菌（E. coli）：属于肠杆菌科的革兰氏阴性菌，是一类重要的肠道微生物，其成员既有与宿主共生无害的非致病株，也有引发疾病的致病株，而致病性大肠杆菌是全球食物源性疾病的重要病因。其细胞外形呈直杆或稍弯的杆状，细胞表面具有用于运动的鞭毛结构，无芽孢形成能力。其传播途径多样，包括粪口传播、人际与人畜直接接触，以及通过污染的水、食物链等。
知识点3 — 不同氨基酸残基编号的意义
组成多肽的氨基酸在相互结合时，由于其部分基团参与了肽键的形成而失去一分子的水，因此把多肽中的氨基酸单位称为氨基酸残基。即由肽键连接的氨基酸失水后剩余部分。氨基酸残基编号通常由一个字母和一个数字组成，用于标识蛋白质中不同的氨基酸残基位置。字母代表氨基酸的缩写，数字代表在蛋白质序列中的顺序位置。这种编号方式常用于描述特定氨基酸在蛋白质结构、功能或相互作用中的位置。例如：“Y152”表示酪氨酸（Tyrosine，Y）在蛋白质序列中的第152个位置；“N240”表示天冬氨酸（Asparagine，N）在蛋白质序列中的第240个位置；“L142”表示亮氨酸（Leucine，L）在蛋白质序列中的第142个位置。
金黄色葡萄球菌（S. aureus），尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），会引起伤口感染，其治疗仍然是临床上的一个难题。细菌感染的伤口通常会产生pH值为4.5 - 6.5的酸性微环境。而噬菌体内溶素（LysSYL）则有望成为一种有效的抗葡萄球菌药物。然而，LysSYL在酸性微环境中通常表现出不稳定性，且生物利用度也较低。在这里，陆军军医大学基础医学院饶贤才教授（通讯作者）、尚伟龙副教授（通讯作者）和卢曙光副教授（通讯作者）团队设计了一系列pH敏感的自组装多肽，并根据其凝胶形成特性和生物利用度筛选出了多肽L5。L5在中性pH下（pH 7.4）形成生物相容性水凝胶，并在酸性条件（pH 5.5）下表现出广谱的抗菌活性。负载LysSYL的L5可以组装成L5@LysSYL水凝胶，以提高热稳定性，并发挥LysSYL的缓释作用。L5@LysSYL能够通过破坏细菌膜和抑制细胞分离，有效消除S. aureus。此外，L5@LysSYL水凝胶在MRSA感染的小鼠伤口模型中表现出促进伤口愈合的巨大潜力，可以降低炎症细胞因子水平并增加血管形成的关键因子水平，从而促进伤口愈合。此外，L5@LysSYL水凝胶具有生物安全性。总体而言，自组装L5@LysSYL可以有效清除MRSA并促进伤口愈合，这表明它有可能成为一种pH敏感的伤口敷料，用于治疗伤口感染。
本研究针对细菌感染伤口环境（pH 4.5 - 6.5）设计合成了一系列pH响应性自组装肽，并筛选出一种称为L5的多肽用于递送LysSYL。单独的L5肽可以在中性条件下（pH 7.4）自组装形成水凝胶，并在酸性环境中（pH 5.5）分解以发挥广谱抗菌活性。封装LysSYL后，超分子L5@LysSYL水凝胶表现出缓释效果，并提高了LysSYL的稳定性和生物利用度。此外，L5@LysSYL水凝胶能够通过破坏细菌膜、扰乱跨壁和抑制细胞分离有效消除MRSA，还能够通过降低炎症细胞因子水平和增加血管形成的关键因子水平来促进伤口愈合。
（a、b）琼脂平板法测定自组装肽水凝胶抑制S. aureus的抗菌活性并进行细菌菌落计数统计，以进行抗菌能力筛选。结果表明，肽L2、L3、L5、L7、L8和L9在pH 5.5时对S. aureus表现出抗菌活性，但在pH 7.4时不表现出抗菌活性，这证实了其pH敏感的抗菌活性。其中肽L3和L8对S. aureus表现出最高的抗菌潜力，这一发现可能归因于R侧链或多个H残基的存在。（c、d）HaCaT细胞与肽水凝胶提取物（7.5 mM，pH 7.4）共孵育24 h（c）和48 h（d）后，通过CCK-8测定法检测了细胞的活力，以确定肽水凝胶的细胞毒性。各组水凝胶提取物处理的HaCaT细胞在孵育24 h后皆达到了100%以上的相对增殖率，但只有L5在孵育48 h后仍然显著促进细胞增殖。且与其他组相比，在24 h和48 h时，用L5处理可使HaCaT细胞增殖率达到最高。（e、f）肽L2-L9水凝胶对小鼠红细胞的溶血率及相应组别溶血实验的图片。由结果可见，自组装肽水凝胶表现出剂量依赖性增加的溶血活性。其中，L5水凝胶对小鼠红细胞表现出最低的溶血活性，在2500 μM浓度下溶血率仅为0.20%。这些数据表明肽L5水凝胶具有更突出的生物相容性。因此，基于其抗菌活性和生物相容性，肽L5成为进一步研究的主要肽。
（a、b）肽L5在中性和酸性条件下的化学结构和电荷状态，以及L5在中性pH下形成超分子肽水凝胶的分子间相互作用。如图所示，设计的赖氨酸（K）和谷氨酸（E）残基可在pH 7.4下为肽L5水凝胶的形成提供中性电荷。然而，H残基的R侧链和咪唑基团易被质子化，并在pH 5.5时显示正电荷，这可能导致自组装超分子水凝胶网络的崩溃。因此，两亲性L5的生物相容性可能归因于其在中性条件下的分子间静电相互作用、疏水堆积和氢键作用。（c）可注射性实验结果可见，L5水凝胶可通过内径0.4 mm的针头注入圆盘中，成功形成“GEL”字样，表明L5水凝胶具有良好的注射性。（d）采用小瓶倒置法评估了L5的pH响应性凝胶形成性能。L5在室温下静置30 min后在pH 7.4下形成了固体凝胶，而在酸性条件下（pH 5.5）出现了不稳定的凝胶态。（e）L5的圆二色谱（CD）分析进一步证实了其二级结构在不同pH环境下的变化。L5在pH 7.4下的CD光谱在195和208 nm处有正峰和负峰，分别对应于β片层和α螺旋构象。然而，L5的CD光谱在pH 5.5下发生了显著变化，并在200 nm处呈现负峰，这表明L5在pH 5.5下呈随机卷曲构象。（f-i）在用pH 7.4和5.5的L5处理后，通过流式细胞术检测S. aureus（f、g）和P. aeruginosa（h、I）的碘化丙啶（PI）阳性细胞及死菌百分比，以进一步证实L5对革兰氏阳性S. aureus和革兰氏阴性P. aeruginosa的pH可控抗菌活性。结果表明，经L5（pH 5.5）处理4 h后，PI可渗透的S. aureus和P. aeruginosa细胞百分比分别达到30.2%和11.3%，明显高于pH 7.4下经L5处理的细胞百分比（分别为0.32%和0.12%）。这一发现表明L5可以在酸性条件下破坏细胞膜。
（a）用L5（pH 7.4或5.5）处理细菌4 h后细菌活/死染色的荧光图像。结果可见，与pH 5.5的L5水凝胶孵育的MRSA和P. aeruginosa出现了大量的死细菌。同时，在用pH 7.4的L5水凝胶处理后，只观察到了少量的死细菌。（b）显示了用pH 7.4的L5水凝胶处理的MRSA和P. aeruginosa细胞具有完整细胞形态和光滑表面。然而在与pH 5.5的L5水凝胶一起孵育后表现出了明显的细胞膜变形和表面塌陷现象。（c）显示L5水凝胶在酸性条件下能够以剂量和时间依赖的方式消除不同耐药S. aureus。（d）对不同耐药S. aureus、A. baumannii、P. aeruginosa和E. coli的抗菌活性检测结果可见，L5水凝胶在酸性条件下表现出广谱抗菌能力，这意味着其作为伤口敷料抗菌剂的潜力。
（a-c）pH值为7.4和5.5时L5的代表性冷冻电镜（cryo-EM）图像、透射电子显微镜（TEM）图像和原子力显微镜（AFM）图像。其中cryo-EM显示，pH 7.4的L5水凝胶表现出均匀和缠结的3D多孔形态，平均孔径为5.6 μm，这为药物递送提供了合适的超分子网络。然而，3D超分子网络在酸性条件下被分解和破坏，这可能是由L5序列中K和H残基的质子化导致的。而TEM和AFM也揭示了pH 7.4下L5水凝胶中具有长而弯曲的纳米纤维网络，这种纳米纤维在酸性条件下则变得不完整和断裂。（d、e）进一步检测了pH 7.4和pH 5.5时L5纳米纤维的直径。由图可知，L5在pH 7.4时的纤维直径（8.9 ± 0.8 nm）显著大于pH 5.5时的纤维直径（6.1 ± 0.4 nm）。
（a）在4 ℃下LysSYL对MRSA的抑制性可达100%，并且在80 ℃下预处理10 min的LysSYL和L5@LysSYL的相对杀菌活性进行了测定和指示，L5@LysSYL水凝胶的杀菌活性比游离LysSYL高21.7%，显示了LysSYL在L5水凝胶中包封后的热稳定性。（b）L5@LysSYL水凝胶和L5水凝胶的G’都大于G”，证实了水凝胶的形成。而L5@LysSYL的G’值大于L5，这表明L5@LysSYL水凝胶的机械性能优于L5水凝胶，这是因为加入LysSYL后L5水凝胶中交联度增加了。（c）通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析，显示所有测试样品在3400和2900 cm−1处均出现了吸收峰，分别对应于O-H、N-H和C-H的伸缩振动。观察L5@LysSYL水凝胶发现了LysSYL（1740 cm−1）和肽L5（1637 cm−1）的典型FTIR峰，这表明LysSYL已成功封装在L5@LysSYL水凝胶中。L5@LysSYL（1637 cm−1）和L5（1636 cm−1）水凝胶显示出相同的峰形，这表明LysSYL的负载对L5水凝胶结构没有影响。（d-g）pH值为7.4时，cryo-EM显示L5@LysSYL的平均孔径（22.5 μm）明显大于L5水凝胶（5.6 μm）。TEM显示，L5@LysSYL具有与pH 7.4时的L5相似的纳米纤维网络，AFM揭示L5@LysSYL的纤维直径（13.2 ± 0.5 nm）大于pH 7.4 （8.9 ± 0.8 nm）和pH 5.5 （6.1 ± 0.4 nm）时的L5。（h）采用高效液相色谱（HPLC）检测pH值为7.4和5.5时L5@LysSYL水凝胶中LysSYL的累积释放量，酸性pH下LysSYL在12 h开始时从L5@LysSYL中快速释放，并在120 h内持续释放。在中性和酸性pH下，负载LysSYL的水凝胶在72 h时的累积释放百分比分别达到17.9%和83.6%，这表明在病理感染的伤口环境（pH 5.5）中释放LysSYL的灵敏度高4.7倍。这些结果表明pH对L5@LysSYL水凝胶中LysSYL的释放曲线有显著影响，且表明在低pH值下LysSYL的释放速率很快。其原因可能归因于L5@LysSYL水凝胶中纳米纤维形态的变化。
（a）菌落计数试验检测L5@LysSYL对MRSA的杀菌活性。与单独使用L5处理相比，用L5@LysSYL处理1、8、16或24 h可显著减少MRSA的数量。这表明用L5水凝胶封装溶菌素LysSYL后，L5@LysSYL对MRSA的抗菌活性会增加。（b）此外，进行了光密度（OD）测量以评估由L5@LysSYL、游离LysSYL和L5处理后MRSA的生长抑制情况。在pH 7.4和5.5下未经水凝胶处理的MRSA获得了相似的生长曲线，而对于L5@LysSYL处理组，在pH 5.5时细菌生长逐渐被L5@LysSYL抑制，处理后24 h抑制效果最佳。这些发现表明L5@LysSYL水凝胶具有缓释效果。在pH 5.5时肽L5略微抑制MRSA的生长。而在pH值为7.4时，由LysSYL处理的MRSA可在18h内被显著抑制生长，随后显示出显著增加。（c）进行了RNA测序（RNA-Seq） 以探索L5@LysSYL对MRSA细胞的影响，图示为用L5@LysSYL处理MRSA 1 h后的总差异表达基因（DEG）的火山图分析。用L5@LysSYL处理后，在MRSA中共鉴定出429个差异表达基因，其中上调基因187个，下调基因242个。（d、e）上调和下调DEG的GO富集分析表明，用L5@LysSYL水凝胶处理后，MRSA中涉及膜、ATP结合盒式转运蛋白（ABC）、跨膜转运和磷酸烯醇式丙酮酸依赖性糖磷酸转移酶系统（PTS）的基因受到显著抑制。该结果表明L5@LysSYL能够直接靶向MRSA细胞膜并损害膜功能。而主要与细胞内细胞器、细胞质部分、核糖体和其他细胞成分相关的基因显着上调，这表明细菌可能启动修复过程，以尽量减少L5@LysSYL的损伤。（f）与跨膜转运相关的mhG2、mnhF2、SAUSA300_RS06675和phnE基因的每千碱基百万片段数 （FPKM）。结果和前述发现相同，编码跨膜转运相关蛋白的基因显著下调，L5水凝胶可通过膜破坏诱导MRSA细胞死亡。（g）DEG的KEGG富集分析（红色：某些代谢途径的上调DEG的数量，蓝色条：某些代谢途径的下调DEG的数量）显示，与PTS、氮代谢、萜类骨架生物合成、群体感应、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及C5支链二元酸代谢相关的途径受到明显影响。
（a）通过建立MRSA感染全层皮肤伤口模型来评估L5肽水凝胶敷料的伤口愈合效果。在第0、3、7和14天观察伤口，并在第7和第14天收集伤口组织。（b-d）在第0、3、7和14天使用LysSYL、L5、L5@LysSYL和市售莫匹罗星（Mup）敷料（阳性对照）治疗后，受感染的全层伤口的代表性照片、14天内伤口闭合进展示意图及伤口闭合率。与其他组相比，经L5@LysSYL水凝胶治疗的小鼠在第7和第14天的伤口愈合效果最佳。（e）第7天和第14天伤口组织的细菌计数统计。与其他治疗组相比，用L5@LysSYL水凝胶治疗后伤口皮肤中的细菌负荷显著减少，而其他治疗组的细菌数量与PBS对照组相当。（f-i）通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测第7天伤口组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和白细胞介素-10（IL-10）的细胞因子水平。结果显示，与PBS对照组相比，L5@LysSYL水凝胶降低了伤口部位促炎细胞因子和趋化因子的水平，但增加了抗炎细胞因子白细胞介素10 （IL-10）的水平。经L5@LysSYL治疗的小鼠的细胞因子和趋化因子的改变程度优于单独使用LysSYL和L5治疗的小鼠，这表明伤口愈合从炎症期转变为增殖期。
（a、b）各治疗组感染伤口组织在第7天和第14天的H&E和Masson三色染色图，及各组的胶原沉积百分比统计。与正常皮肤组织相比，PBS处理的MRSA感染小鼠的伤口组织在第7天显示出薄而松散的未成熟肉芽组织，主要有炎症细胞浸润、成纤维细胞和血管稀疏沉积存在。第14天形成中等厚度的炎症肉芽组织，以炎症细胞形成为主，并出现大量新生血管。相比之下，L5@LysSYL水凝胶治疗组表现出正常的皮肤结构，皮下纤维组织排列有序，第14天炎症消失。此外，通过Masson染色以观察各治疗组中新生胶原蛋白的形成。第14天，L5@LysSYL治疗组胶原沉积率最高（38.4%），与正常组（41.8%）相当。这一发现表明L5@LysSYL加速了总胶原形成和沉积。（H&E 图像中黑色箭头表示主要炎症细胞浸润，黄色箭头表示成纤维细胞沉积，红色箭头指向新生血管，橙色箭头表示胶原沉积。Masson图像中，白色箭头表示胶原沉积。）（c-e）采用RT-qPCR检测伤口组织中vegf、egf、fgf的相对表达量。由图可见，与第7天接受PBS治疗相比，经L5@LysSYL水凝胶治疗后，vegf、egf和fgf的表达显著增加。
（a、b）CD31染色的代表性图像及CD31阳性点的密度统计。与PBS治疗组相比，在L5@LysSYL水凝胶治疗后观察到了更多的CD31，这表明形成了更多的血管。（蓝色箭头代表CD31阳性细胞。）（c、d）VEGF染色的代表性图像及血管内皮生长因子（VEGF）阳性点的密度统计。由图可见，L5@LysSYL水凝胶治疗的小鼠在所有组中表现出最高的VEGF表达（红色箭头表示VEGF阳性细胞）。
综上所述，研究员们基于残基性质和功能基序设计了一系列自组装肽，并筛选出具有pH可控的凝胶形成特性、良好的生物相容性、广谱抗菌活性和低溶血作用的肽L5。L5水凝胶能够递送溶菌素LysSYL，并且L5@LysSYL水凝胶易于制备。此外，L5@LysSYL水凝胶提高了LysSYL的稳定性和生物利用度，并呈现出缓释作用。L5@LysSYL对MRSA表现出优异的消除活性，L5@LysSYL杀死葡萄球菌细胞的机制可能涉及膜破坏和跨细胞壁抑制。体内研究表明，L5@LysSYL水凝胶安全且能有效促进感染伤口愈合，有望成为一种治疗MRSA感染的有前途的pH敏感系统。总的来说，研究中的集成水凝胶系统为开发用于治疗伤口感染的伤口敷料开辟了一种新方法。
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