上海交大环境学院EST：利用非靶向分子网络方法鉴定土壤中的新型碘化多氟烷基醚酸和其他新兴PFAS

文摘 2025-01-01 10:44 浙江

摘要

尽管高分辨率筛查技术有所进步，但在没有先验结构信息的情况下，新型全氟烷基和多氟烷基物质（PFAS）的鉴定仍然具有挑战性。有鉴于此，我们提出并实施了一种新的数据驱动算法来计算PFAS之间的光谱相似性，从而便于生成分子网络以筛选未知化合物。利用这种方法，在中国山东省一个工业园区附近采集的土壤样品中鉴定出了12个不同类别的81种PFAS，包括首次报道的12种碘取代的PFAS。其中，四种碘取代的多氟醚磺酸盐（I - PFESA）标准品成功合成，从而能够进行结构确认和后续定量分析。尽管土壤样品中∑I - PFESA的中位浓度（0.74纳克/克干重）低于∑H - PFESA（氢取代，61.96纳克/克干重）和∑Cl - PFESA（氯取代，2.98纳克/克干重），但斑马鱼胚胎毒性试验表明，6:2 I - PFESA比相同链长的6:2 Cl - PFESA具有更大的毒性。这突出了需要更仔细地研究I - PFESA的毒性作用。值得注意的是，基于新型PFAS光谱相似性提出的算法为I - PFESA的环境行为和转化提供了新的视角，尽管需要进一步研究来阐明其毒性的潜在机制。

关键词：全氟和多氟烷基物质；碘化多氟烷基醚磺酸；非靶向分析；分子网络；环境转化

一、研究背景

（一）PFAS的基本情况与危害

1. 广泛应用与特性

- 全氟和多氟烷基物质（PFAS）是一类合成有机氟化合物，广泛用于消费品制造、食品包装、消防泡沫以及各种工业过程。其具有环境持久性，难以自然降解，在环境中可长期存在。

2. 健康风险关联

- 与癌症、免疫抑制和生殖障碍等不良健康问题密切相关。长期接触PFAS可能对人体的免疫系统、内分泌系统和生殖系统等造成损害，影响人体健康。

（二）PFAS定义的演变与环境中新型PFAS的存在

1. 定义的发展与争议

- 随着对PFAS研究的深入，其定义标准不断发展和扩展。根据经合组织（OECD）的最新报告，PFAS被定义为至少含有一个全氟甲基或亚甲基碳原子的物质。这一定义使得众多在PubChem数据库中列出的化合物可能被归类为PFAS，估计数量超过700万种。

2. 新型PFAS的产生与未知性

- 由于PFAS在环境中会发生化学转化，产生了各种新型PFAS，这些物质尚未在现有数据库中被完全记录和分类。其结构和性质的不确定性，使得对它们的研究变得更加重要，以评估其对环境和人类健康的潜在影响。

（三）传统PFAS筛查方法的局限性

1. 高分辨率质谱（HRMS）的优势与挑战

- HRMS在非靶向筛查中具有强大的功能，能够在无需标准参考物或先验化学信息的情况下分析样品，生成大量质谱（MS）和MS/MS数据，从而全面研究样品成分，包括发现未知的PFAS。

- 然而，HRMS数据量庞大且复杂，每个样品通常包含数千个特征，这给PFAS的鉴定带来了巨大挑战，复杂的数据也使得关键信息难以提取，光谱解释变得困难。

2. 传统筛查方法的不足

- 基于HRMS的传统PFAS鉴定方法，如可疑物筛查、特征片段筛查、同源筛查和特征中性损失筛查等，主要侧重于在实际样品数据中检测预定义的PFAS特征。

- 这些方法在处理完全未知的PFAS时存在固有局限性，因为其依赖先验知识，对于光谱行为与已知PFAS差异较大的新型PFAS，可能无法有效检测。

（四）分子网络技术的现状与在PFAS研究中的问题

1. 技术原理与应用

- 分子网络技术是一种数据驱动的非靶向筛查方法，通过分析和比较主要光谱峰之间的相似性来构建代表分子结构和性质相似性的网络图，有助于识别和预测化合物功能，已在多种化学物质的鉴定中得到应用。

图 1.PFAS 分子网络生成的工作流程。

2. 在PFAS研究中的缺陷

- 传统分子网络技术使用余弦相似度描述光谱相似性，在表征PFAS时存在不足。不同类别的PFAS，即使结构相似，由于碎片化过程不同，产生的碎片也可能有很大差异。

- 例如，6:2氯化多氟烷基醚磺酸盐（6:2 Cl - PFESA）和6:2氢取代多氟烷基醚磺酸盐（6:2 H - PFESA）仅一个取代原子不同，但光谱碎片几乎完全不同，导致余弦相似度低，影响了对PFAS结构相似性的准确判断，进而限制了对未知PFAS的鉴定能力。

二、研究目的

1. 开发一种新的PFAS分子网络筛查方法，利用新设计的PFAS光谱相似性算法，减少非靶向PFAS筛查对先验知识的依赖。

2. 通过合成四种碘化多氟烷基醚磺酸盐（I - PFESA）标准品，对新发现的PFAS进行结构确认和定量分析，填补环境中I - PFAS研究的知识空白。

3. 深入探究I - PFESA在环境中的潜在转化途径，了解其在环境中的行为和变化规律。

4. 评估新发现的I - PFESA对斑马鱼的毒性影响，初步判断其对水生生物的危害程度。

三、研究方法

（一）样品采集与制备

1. 采样地点与时间

- 2024年4月在中国山东省一家氟化工厂周边采集了20个土壤样品。采样点的选择基于之前的报告，考虑了潜在的I - PFAS生产情况，并根据当地季风风向，在距离工业园区不同位置设置采样点，以研究PFAS在环境中的迁移情况。

2. 样品处理过程

- 土壤样品经冻干和研磨后，取0.5g等分试样，加入1ng质量标记标准物。试样在含有0.1mM KOH的10mL甲醇中冰浴超声1h，然后过夜振荡，室温下以4400rpm离心15min。收集上清液，残渣用另一10mL甲醇/KOH重新萃取，合并萃取液，干燥后用10mL含1% v/v乙酸的Milli - Q水重新溶解以调节pH值。最后将样品上样至用含0.5% v/v氢氧化铵（NH₄OH）的甲醇预处理过的Oasis WAX SPE小柱，依次用甲醇和水淋洗，再用4mL乙酸缓冲液（pH 4）和甲醇洗涤，目标分析物用4mL含0.5% NH₄OH的甲醇洗脱，浓缩至干，用0.5mL甲醇/水（40:60）重新溶解。

（二）仪器分析

1. 分析仪器与条件

- 采用超高效液相色谱（Vanquish Flex UHPLC，赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州）与四极杆轨道阱质谱（Orbitrap Exploris 120，赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州）联用，在负电喷雾电离（ESI -）模式下对样品进行分析。

- 液相色谱柱选用Poroshell 120 EC - C18柱（150mm×3mm，2.7μm，安捷伦科技，美国加利福尼亚州圣克拉拉）。数据采集采用数据依赖分析模式，在一个循环中包括一次全扫描（质量范围80 - 1000，分辨率60,000）和四次MS/MS扫描（质量范围50 - 1000，分辨率15,000）。

（三）数据处理

1. 数据格式转换与峰特征识别

- 首先将Orbitrap MS的原始数据进行质心化处理，并转换为mzML和mgf格式。然后使用R脚本（利用patRoon包中的函数），按照特定参数识别和分组样品中的峰特征。

2. MS/MS光谱匹配与优化

- 保留前体强度最高的MS/MS光谱，将其与检测到的峰进行匹配。为提高准确性，对MS/MS光谱应用10%的相对丰度阈值，以消除低信号峰的干扰，降低识别假阳性片段的可能性。这一过程使用MATLAB脚本完成。

（四）MS/MS相似性分数计算

1. 相似性分数计算方法

- 开发了一种新的计算MS/MS光谱相似性分数的方法，针对每对MS/MS光谱，计算三个独立的相似性分数（1 - 3）以从不同维度评估其光谱相似性。

- 相似性分数1表示在指定误差范围内两个光谱之间匹配片段的数量，通过比较两个光谱中碎片的m/z值来计算。

- 相似性分数2表示在特定误差范围内，两个光谱之间匹配片段数量，其中差异符合预定义的PFAS特征差异，考虑了特定结构单元的质量差异。

- 相似性分数3表示两个光谱之间的最小损失（前体与最大碎片之间的质量差）是否在特定误差范围内一致。

2. 综合相似性分数计算

- 最后使用三个相似性分数（1 - 3）作为参考点，通过加权求和计算综合相似性分数，其中涉及权重系数（aᵢ和bᵢ），具体参数在研究中有详细设定。

（五）网络生成

1. 相关热量计算与网络构建

- 通过将每个光谱与其他所有光谱的相似性分数求和来量化其相关热量，基于两个节点之间的非零相似性分数构建PFAS网络，重点关注高相关性的PFAS、高强度PFAS（如PFOA）、高毒性PFAS或研究中突出的其他化合物等节点。

图 2.本研究中生成的 PFAS 网络。（a）本研究中使用网络生成方法鉴定的所有 PFAS 的网络。（b） PFCA 型 PFAS 网络。（c） X-PFESA 型类（X = Cl， H， I）的网络。（d） I-PFAS 型 PFAS 网络。圆圈代表网络中每个 PFAS 对应的节点。节点之间虚线的长度与节点之间的 Similarity Score 值成反比。

（六）筛查与鉴定方法

1. 可疑物筛查

- 采用四个可疑物列表进行可疑物筛查：内部数据库（包含68种具有MS/MS光谱的参考标准物）、赛默飞世尔商业PFAS数据库（包含111种MS/MS光谱）、OECD新综合全球数据库（包含4730种PFAS）和EPA PFASSTRUCT列表（包含14,735种PFAS）。

2. 特征片段筛查

- 使用特定函数搜索所有光谱中匹配的特征片段（m/z），对满足匹配质量误差<5ppm且至少有两个匹配片段标准的光谱进一步鉴定。

3. PFAS鉴定与定量

- 用72种PFAS标准品通过MS/MS比较进行结构确认，手动验证并考虑结构干扰后，将所有鉴定出的PFAS分配到不同置信水平。对检测频率超过60%的PFAS使用标准参考物进行定量或半定量分析，详细的定量方法在研究中有提供。

（七）毒性评估

- 按照OECD TG 236指南进行斑马鱼胚胎毒性测试，获取三种I - PFESA和三种Cl - PFESA的毒性数据。暴露溶液用PFAS标准品和Milli - Q水配制，实验过程中每天用新鲜培养基更新测试溶液以保持恒定暴露浓度，每24h从6孔板中去除死胚胎和碎屑，使用光学显微镜观察胚胎形态异常，如未膨胀的鱼鳔（USB）、卵黄囊水肿（YE）、心包水肿（PE）和脊柱弯曲（SC）。

四、研究结果

（一）方法性能

1. 数据提取与分析结果

- 从20个土壤样品中使用XCMS提取了204,385个MS/MS光谱和6155个峰，然后用MATLAB脚本与MS/MS光谱进行匹配。经质量缺陷过滤（CF₂归一化质量缺陷>0.85或<0.15）后，选择2006个峰进行相似性计算和分子网络构建。通过结构分析相关光谱，鉴定出12类81种PFAS，置信水平（CL）在1 - 3之间，其中包括首次发现的两种I - PFCAs、八种I - PFESAs和两种不饱和I - PFESA。

图 3. 6：2 I-PFESA 在土壤和标准样品中的保留时间和 MS2 谱图。

2. 不同筛查方法对比

- 除分子网络方法外，还采用了可疑物筛查和特征片段筛查进行比较。可疑物筛查鉴定出59种特征PFAS物种，特征片段筛查基于特定特征片段鉴定出37种PFAS。分子网络方法优先考虑PFAS特征的光谱相似性，而不是仅依赖传统的余弦相似性，能够成功识别出结构相似但碎片模式不同的化合物之间的相似性，如6:2 I - PFESA和6:2 Cl - PFESA，尽管余弦相似度低，但分子网络方法可通过最小损失特征建立联系。

（二）PFAS的环境分布

1. 不同类型PFAS的分布特征

- PFAS在环境中的分布以PFCA和H - PFESA化合物为主。在距离氟化工厂最近的采样点，H - PFESA浓度最高，达到1400ng/g。随着与工厂距离的增加，三种X - PFESAs的浓度逐渐降低，表明工厂排放可能是这些PFAS的主要来源。

2. 浓度分布趋势与影响因素

- 污染区PFAS总浓度热图显示，随着与污染源距离的增加，PFAS浓度呈下降趋势。然而，污染源北部和东南部的部分区域仍呈现较高的PFAS浓度，可能是由于风向和水流等环境扩散因素的影响。不同类型和链长的X - PFESA在土壤样品中的浓度分布表明，H - PFESA浓度明显高于其他两种PFESAs，四种H - PFESAs的总浓度中位数达到61.96ng/g。此外，6:2 Cl - PFESA和8:2 Cl - PFESA的浓度显著高于相同碳链长度的I - PFESA，而2:2 I - PFESA和4:2 I - PFESA则高于相同碳链长度的Cl - PFESA。在碳链长度分布方面，三种X - PFESAs主要以偶数个碳原子的形式存在，奇数碳链长度的物质浓度和检测率较低。

图 4.研究区域 PFAS 的浓度分布。（a）研究区域中 5 类 PFAS 的概况和浓度。（b）研究区域 PFAS 总浓度的热图。（c）研究区域 n：2 X-PFESA （X = Cl， H， I）的浓度分布。

（三）X - PFESA的环境转化

1. 工业合成与副产物形成

- 通过研究X - PFESAs的化学合成途径，探讨其在环境中的来源和转化。在传统工业合成6:2 Cl - PFESA（F - 53B）的过程中，四氟乙烷β - 磺内酯（TFES）作为前体产生I - (CF₂CF₂)ₙOC₂F₄ - SO₂F中间产物，该产物经氯化反应，Cl₂取代I原子形成Cl - PFESA，同时 - SO₂F结构在浓KOH溶液中转化为 - SO₃K。通过实验验证，不完全的Cl₂取代可能导致功能基团转换而不发生I被Cl取代，从而产生I - PFESA副产物。

2. 环境转化途径与机制

- 6:2 Cl - PFESA在环境中可转化为6:2 H - PFESA，I - PFESA中的I原子比Cl更活泼，更容易发生还原转化为H - PFESA。例如，在弱碱性条件下，氟烷基卤化物（RfCF₂X，X = Br、I）容易发生氢卤化反应，I - (CF₂)₂O(CF₂)₂SO₂NH₂可转化为H - (CF₂)₂O(CF₂)₂SO₂NH₂。X - PFESA的环境转化途径可能是工业生产排放的副产物（如n:2 Cl - PFESA和I - PFESA）在环境中逐渐转化为更持久的H - PFESA。

（四）I - PFESA与Cl - PFESA的毒性比较

1. 形态异常与剂量 - 效应关系

- 斑马鱼胚胎暴露于X - PFESA后出现一系列形态异常，包括未膨胀的鱼鳔（USB）、卵黄囊水肿（YE）、心包水肿（PE）和脊柱弯曲（SC），其中USB畸形最为常见。结果表明，随着PFESA剂量的增加，USB和SC的严重程度呈剂量依赖性增加，尤其是USB。

2. 有效浓度计算与毒性比较

- 计算了六种测试物质的EC10、EC20和EC50值，8:2 I - PFESA和8:2 Cl - PFESA毒性最高，SC的EC值范围为0.54 - 0.77mg/L，USB的EC值范围为0.68 - 0.91mg/L。6:2 I - PFESA和6:2 Cl - PFESA在浓度分别为0.98、1.10、1.35mg/L和4.08、4.56、5.51mg/L时，120h暴露后导致10%、20%和50%的畸形率。4:2 I - PFESA和4:2 Cl - PFESA毒性最低，120h USB的EC50值分别为1.10和4.56mg/L。总体而言，相同碳链长度的I - PFESA比Cl - PFESA毒性更大，且I - PFESA的USB EC50值低于常见研究的PFAS（如PFOA、PFOS和HFPO - DA），需要进一步研究其毒性影响和生态风险。

五、研究结论

1. 本研究提出的分子网络方法为鉴定未知PFAS提供了有力工具，成功鉴定出12种前所未有的I - PFAS，合成了四种I - PFESA标准品，确定其为6:2 Cl - PFESA生产过程中的副产物。

2. 分子网络方法有助于深入理解污染物的光谱行为和环境转化途径，毒性测试表明I - PFESA副产物的毒性强于传统PFAS（如PFOA和PFOS）。这些副产物在环境中的释放可能带来潜在的生态和健康风险，凸显了关注PFAS生产过程中潜在共污染物的必要性。

Ji, Y., Pan, Y., Miao, X., Wang, C., Sheng, N., Su, Z., Yeung, L. W. Y., & Dai, J. (2025). Identification of Novel Iodinated Polyfluoroalkyl Ether Acids and Other Emerging PFAS in Soils Using a Nontargeted Molecular Network Approach. Environmental Science & Technology, 59(1), 253-263. https://doi.org/10.1021/acs.est.4c11961

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