ACS EST Water：利用 UHPLC-HRMS-MS 鉴定微囊藻毒素生物降解产生的新型肽

文摘 2025-01-02 17:08 浙江

这篇论文主要研究了从伊利湖分离出的一组细菌对微囊藻毒素（MCs）的生物降解过程，重点在于鉴定降解产物的结构。研究发现了三种新型的四肽异构体和一种环状三肽，提出了它们的形成机制，并在自然水样中检测到了这些肽，为阐明MCs在伊利湖中的生物降解途径提供了重要依据。

研究背景

微囊藻毒素（MCs）是蓝藻产生的有害次生代谢产物，其中MC-LR分布广泛且毒性强，对人类和动物健康造成严重威胁，如导致肝损伤、肿瘤形成等。细菌降解MCs是一种环保的解毒方法，此前已有研究表明细菌可通过多种途径降解MCs，但伊利湖细菌对MCs的降解途径仍不完全清楚。因此，本研究旨在鉴定从伊利湖分离的细菌降解MC-LR过程中产生的降解产物结构，以进一步了解MCs在该环境中的生物降解机制。

图 1.具有氨基酸位置和残基质量的微囊藻毒素的一般结构。位置 2 和 4 的氨基酸变化最大。显示了 MC-LR 位置 2 和 4 的氨基酸残基质量。图中显示了 135.08 m/z 处的 Adda 碎裂离子，用于鉴定 MC 和 MC 的降解产物。

实验材料与方法

1. 材料：购买MC-LR标准品及各种溶剂、注射器、过滤器等实验用品。

2. 仪器：使用Vanquish UHPLC仪器与高分辨率Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪联用进行分析。

3. 细菌培养与样品制备

- 从伊利湖采集水样作为细菌培养基，培养五种能降解MC-LR的细菌菌株（Cellulophaga sp.、Sphingobium yanoikuyae、Rhizobium sp.、Porphyrobacter sp.和Pseudomonas sp.）。

- 定期收集细菌培养物和对照样品，经预处理后进行LC-MS分析，部分样品进行巯基衍生化反应后再分析。

4. 液相色谱 - 质谱分析：优化UHPLC-MS条件，采用选择离子监测（SIM）模式，在正、负电离模式下收集数据，通过特定碎片离子鉴定含Adda的MC降解产物，并进行绝对和相对定量分析。

实验结果与讨论

1. 四肽的鉴定

- 利用高分辨率MS和低分辨率MS/MS监测到三种理论精确质量为615.3389 m/z的四肽异构体（Adda-TetraP-1、Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3），其中Adda-TetraP-1为已知降解产物，Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3为新发现的异构体。

- 低分辨率HCD-MS/MS光谱显示，Adda-TetraP-1含有特定的碎片离子，而Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3中未检测到，表明后两者结构中Glu或Mdha可能被修饰。

2. 四肽CID-HR-MS/MS光谱比较

- 通过改变碰撞能量（CE）获取高分辨率CID-MS/MS数据，发现Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3在较低CE下几乎不发生碎片化，结构比Adda-TetraP-1更刚性。

- Adda-TetraP-1在碎片化过程中产生多种特征碎片离子，与其他两者不同，进一步表明它们结构存在差异。

图 3.（a） Adda-TetraP-1、（b） Adda-TetraP-3 和（c） Adda-TetraP-2 的 SIM-Orbitrap-MS 谱图及其相应的 HCD 离子阱-MS/MS 谱图，在 40% CE （d–f）下。

3. 四肽HCD-HR-MS/MS光谱分析

- 在不同CE下对四肽进行HCD碎片化并分析，结果与CID相似，再次证实Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3结构刚性更强，且三者结构存在明显差异。

- 在负离子模式下的HCD-MS/MS分析表明，所有四肽均产生m/z 128.03的碎片离子，说明Glu在四肽结构中未改变。

4. 四肽的巯基衍生化反应：对四肽进行巯基衍生化，发现Adda-TetraP-1能形成巯基衍生化产物，而Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3不能，证实了Adda-TetraP-1中Mdha完整，后两者中Mdha被修饰。

5. 四肽结构的推测

- Adda-TetraP-1中的Adda胺基可与Mdha双键发生分子内氮杂 - 迈克尔反应形成环状四肽Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3，且两者为非对映异构体，Adda-TetraP-2形成更快且更丰富。

图 8.线性肽 NH₂ -Adda-Glu-Mdha-Ala-OH的结构（Adda-TetraP-1）。

- 之前研究中线性MC-LR结构异构体的实验结果支持了Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3形成机制的推测，且Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3可能比Adda-TetraP-1毒性更低。

6. 环状三肽（Adda-TriP）的结构解析

- 在MC-LR与细菌孵育19天后检测到Adda-TriP，其高分辨率MS和MS/MS数据显示其结构与Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3相似，且不能与巯基乙醇发生衍生化反应。

- 推测Adda-TriP是由细菌水解Adda-TetraP-2中的Mdha - Ala键形成的。

7. 天然水样中四肽的存在情况

- 在2022年和2023年采集的伊利湖蓝藻水华水样中检测到了Adda-TetraP-1、Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3，表明实验室培养细菌对MC-LR的降解途径可能与伊利湖中的自然降解途径相似。

- 不同时间采集的水样中四肽的存在情况有所不同，推测细菌对MCs的降解可能与蓝藻细胞裂解等因素有关。

研究结论

1. 鉴定出由伊利湖细菌降解MC-LR产生的三种四肽异构体和一种环状三肽，其中Adda-TetraP-2、Adda-TetraP-3和Adda-TriP为新发现的环状肽，含有修饰的Mdha和Adda部分。

2. Adda-TetraP-2和Adda-TetraP-3通过Adda-TetraP-1的分子内氮杂 - 迈克尔反应形成，且为非对映异构体，Adda-TetraP-2可水解为环状三肽Adda-TriP。

3. 在实验室培养和自然水样中均检测到这些肽，有助于阐明MCs在伊利湖中的生物降解途径。

Thenuwara, S. I., Shrestha, U., Westrick, J. A., Huntley, J. F., & Isailovic, D. (2024). Identification of Novel Peptides Originated from Biodegradation of Microcystins Using UHPLC-HRMS/MS. ACS EST Water, 4(12), 5275-5289.

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