全生命周期管理的理念和原则已深深影响着工艺开发以及清洁验证的研究过程。不同于小分子，生物制品暴露在极端pH和/或加热条件下，活性蛋白易降解、变性以致失去药理活性。因此，生物制品的纯化分离过程、耗材与设备的清洁验证条件相对而言稍温和，但必须得符合要求。
那么，实验室层析纯化的绝佳帮手—ÄKTA，究竟能耐受哪些溶剂呢，今天就一起来了解一下吧！
工艺开发中的溶剂类型
一般说来，常用层析（分子筛、亲和、离子交换、混合模式及疏水层析）不涉及有机溶剂的使用。
但特定条件下，如膜蛋白的分离纯化，去垢剂的添加则必不可少；
由于形成包涵体而不得不在变性条件下纯化，则需要高浓度胍或者尿素；
其他类型层析过程、清洗需要引入添加剂如EDTA等时。
ÄKTA层析系统对各添加剂的耐受浓度可参见下表（均可持续性使用）。需强调的是，层析填料对于不同溶剂的耐受情况请参阅填料说明书。
溶剂名称 | 最高浓度 |
吐温20 Tween | 1% |
十二烷基硫酸钠SDS | 1% |
盐酸胍Guanidinium hydrochloride | 6M |
尿素Urea | 8M |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | 1% |
精氨酸Arginine | 2M |
二硫苏糖醇Dithiothreitol (DTT) | 100mM |
巯基乙醇Mercaptoethanol | 20mM |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | 5% |
氯化钾Potassium chloride | 4M |
磷酸Phosphoric acid | 0.1M |
反相层析 (RPC) 与疏水层析原理类似，基于生物分子表面暴露的疏水基团与介质疏水配基之间的相互作用。不同的是，RPC所用到的基团疏水性更强，一般则使用超过8个碳原子的疏水侧链。而为实现洗脱，必须使用非极性有机溶剂（如乙腈或甲醇）来打破这种相互作用。RPC是目前分辨率最高的层析技术，对于多肽、寡核苷酸的分离十分有效。反相层析常用的溶剂耐受情况可参见下表（均可持续性使用）。
溶剂名称 | 最高浓度 |
乙腈Acetonitrile* | 100% |
乙腈/四氢呋喃Acetonitrile/Tetrahydrofuran1 | 85%/15% |
乙腈/水/三氟乙酸 (TFA) Acetonitrile/water/Trifluoroacetic acid (TFA) | 最高0.2% TFA |
乙醇Ethanol | 100% |
异丙醇Isopropanol | 100% |
甲醇Methanol | 100% |
苄醇Benzyl alcohol | 2% |
丙酮Acetone | 10% |
水/有机相/甲酸 | 甲酸含量不超过5% |
乙二醇Ethylene glycol | 50% |
Glycerol甘油 | 50% |
清洁过程中的溶剂类型
清洁过程中TACT（时间、作用、浓度和温度）四个因素通常相互关联，直接决定清洁程序是否成功。清洁剂应基于去除产品残留的能力、与设备的相容性、是否容易去除、是否低毒性等原则进行选择。相较于传统活性物质残留限度计算法，越来越多的行业组织推荐使用基于毒理学数据建立的清洁限度标准。结合工艺步骤确定相应设备的残留量限值，通常选择使用限定区域的设备表面积来计算或采用通用的默认限度上游工艺总有机碳 (TOC) 5-10 ppm，下游工艺TOC 1-2 ppm。有细菌内毒素限度要求的产品，通常检测最终淋洗水，限度一般采取注射用水标准 (0.25 EU/mL) 。
氢氧化钠 (NaOH) 是清洁程序中常用的清洁试剂，可以有效的去除多种杂质且成本很低。大多数的细菌、真菌、病毒以及内毒素都可以被氢氧化钠灭活。对于脂类或者脂蛋白等疏水性杂质可使用有机溶剂，比如20%乙醇或者30%异丙醇，丙酮或者非离子型去垢剂也能奏效。核酸类杂质可以使用1M氢氧化钠和1M氯化钠的混合液去除，DNase也可以用于核酸杂质的去除，但成本会更高。下表是ÄKTA能耐受的CIP溶剂类型，在室温条件下处理时长可达2小时。
溶剂名称 | 最高浓度 |
醋酸Acetic acid | 70% |
Decon 90 | 10% |
乙醇Ethanol | 100% |
甲醇Methanol | 100% |
盐酸Hydrochloric acid | 0.1% |
异丙醇Isopropanol | 100% |
氢氧化钠Sodium hydroxide | 2M |
氢氧化钠/乙醇Sodium hydroxide/ethanol | 1M/40% |
氯化钠Sodium chloride | 4M |
次氯酸钠Sodium hypochlorite | 10% |
溶剂使用的一般原则
实验室ÄKTA系统可胜任pH 2-12范围内的绝大多数水相缓冲体系。
ÄKTA系统具有良好的生物相容性，惰性流路主要由钛、PEEK和高耐受性含氟聚合物等材质组成。
泵头材质为钛合金，尽可能减少铁、镍和铬等可能导致生物分子失活的金属离子的使用，流路中没有不锈钢。
使用2 M NaOH、70%乙酸或甲醇、乙醇和异丙醇等强力清洗剂即可达到良好的清洗效果。但应尽可能避免使用乙酸乙酯、100%丙酮等苛刻溶剂。由于这些溶剂可能溶胀塑料，降低PEEK管的耐压性。
以上准则ÄKTA go及ÄKTA start并不完全适用，应用时请参照相应设备说明书。
若确需长时间使用高浓度有机溶剂，建议将ÄKTA系统泵更换为耐有机溶剂的密封圈组件、混合池也更换成耐有机溶剂密封圈。对于反相层析，需要额外注意不能使用密闭类的收集器 (F9-C/F9) ，可在ÄKTA avant额外连接一个圆盘收集器 (F9-R) 用于分步收集。
完整溶剂耐受条件请参阅设备说明书，如您有任何ÄKTA上使用的溶剂种类及浓度问题，欢迎留言告诉我们，评论区解答。
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完整溶剂耐受条件请参阅设备说明书
