精氨酸 (Arginine, Arg) 分子量为174.20 g/mol，是一种天然的碱性氨基酸，其安全性已得到FDA认可，能用于生物制药工艺中，常作为蛋白质纯化中的溶剂添加剂和蛋白质处方中的保护剂。
其分子结构主要包括3个部分：极性端（由氨基和羧基组成）、脂肪族片段（3个亚甲基）和胍基末端（图1）。胍基的pKa为13.8，使得精氨酸在酸性、中性甚至大多数碱性环境中都带正电荷。精氨酸大多数情况下以特定的盐形式（最常见的是盐酸盐Arg-HCl）使用[1]。
图1：L-精氨酸的基本化学结构图
精氨酸及其盐在增强蛋白质折叠和溶解、抑制蛋白质相互作用和聚集、降低高浓度蛋白质制剂的粘度等方面具有显著的效果[2]。其作用机理目前尚不明确，主要被认为有以下几种作用方式[1, 3, 4]：
静电相互作用：精氨酸带正电，可中和蛋白质表面负电荷，减弱静电吸附，降低蛋白质在层析填料上的保留时间，促进洗脱。其正电性也可以有效增强带正电荷的蛋白分子之间的静电排斥作用，进而减缓蛋白的聚集。
氢键作用：精氨酸侧链的胍基上存在3个氮原子，由于双键和氮原子的孤对电子之间的共轭，正电荷被离域，促进多个氢键的形成。精氨酸可以通过氢键与蛋白质侧链相互作用，从而影响蛋白质之间的氢键。另外，精氨酸也可以通过阻断蛋白质间的盐桥形成来抑制聚集。
疏水相互作用：精氨酸能与暴露在蛋白外层的疏水性氨基酸侧链适度结合，降低蛋白分子间疏水性区域的碰撞机率，从而减少蛋白质分子间因疏水相互作用而引起的聚集和沉淀。
阳离子-π相互作用：精氨酸的胍基会与芳香族氨基酸形成阳离子-π相互作用，以维持蛋白质及其中间体的稳定性。
抗体纯化平台通常包括一个亲和捕获步骤和1-2个精细纯化步骤。抗体纯化阶段，通过在上样、淋洗或洗脱缓冲液中添加精氨酸，有助于去除聚集体 (aggregate) 、宿主细胞蛋白 (HCP) 或者提高回收率及样品的纯度。本次智荟专线将为大家分享精氨酸在抗体亲和、阳离子、疏水以及多模式层析中的几个典型应用案例。
案例一
利用精氨酸促进抗体从亲和柱上洗脱
抗体纯化第一步通常使用Protein A亲和层析进行捕获和富集，通过降低pH（通常在pH 3-4之间）进行洗脱，然后低pH值孵育一段时间进行病毒灭活，再采用碱性缓冲液进行中和。低pH可能会引起抗体构象发生变化，导致聚集。为了防止抗体分子在酸性条件下的进一步聚集，需对洗脱条件进行优化。有研究表明，精氨酸可促进抗体-Protein A复合物的解离并抑制洗脱抗体的聚集[5]。
如下案例中，采用Protein A亲和柱纯化hIgG4，考察不同洗脱液的洗脱效果，结果如图2所示，相比于柠檬酸，精氨酸可以在更高的pH条件下，促进样品洗脱从而提高回收率，而更温和的洗脱条件也避免了样品因为低pH而产生聚集。但是，其他氨基酸（赖氨酸、脯氨酸、甘氨酸和组氨酸）却没那么有效。文章中也利用盐酸胍来洗脱抗体，虽然具有良好的回收率，但洗脱液中出现了更多的聚集体，这可能是因为胍的变性作用造成的[6]。
图2：Protein A纯化hIgG4，不同洗脱液的收率结果
案例二
利用精氨酸在亲和层析中去除HCP
细胞上清中表达的HCP杂质与抗体分子之间可能存在相互作用，这是造成Protein A洗脱样品中HCP水平较高的主要原因。通过增加合适的中间淋洗步骤，可有效清除大部分HCP。
该文章中采用MabSelect亲和填料，搭配PreDictor板快速筛选中间淋洗条件，考察了NaCl (Control) 、精氨酸、EDTA、异丙醇 (IPA) 、丙二醇、辛酸钠、triton x-100、尿素等添加剂在pH 5.5-9.0条件下对HCP的去除效果以及抗体收率的影响。结果如图3所示，表明pH 7-9之间，在合适的浓度范围内，精氨酸和尿素的HCP去除能力最强，丙二醇和triton x-100次之，同时收率可达90%以上[7]。这是因为精氨酸可以通过其侧链上的胍基，破坏HCP杂质和抗体分子之间的静电、疏水和氢键相互作用；而尿素直接与抗体分子形成氢键，同时改变溶剂环境，从而减轻导致HCP-抗体相互作用的疏水效应，但高浓度尿素会解开蛋白质的三级结构。
图3：pH 5.5-9.0条件下，不同淋洗缓冲液淋洗HCP结果 (A) 和抗体收率结果 (B)
案例三
利用精氨酸改善阳离子交换层析 (CEX) 中的洗脱双峰问题
由于许多抗体的pI相对较高，当选择的缓冲体系低于其等电点1-2 pH时，抗体带正电荷，会与CEX填料上的负电荷基团结合，随后可通过改变pH或/和盐浓度来进行洗脱，以捕获抗体并去除包括聚集体和电荷异构体在内的杂质。但在洗脱阶段有时会出现双峰或多峰现象，这可能是因为形成了组氨酸质子化异构体、或者形成了可逆或不可逆的自聚集导致的。
有文献报道[8]，在Capto SP ImpRes的洗脱液中加入带正电荷的氨基酸（50 mM精氨酸、组氨酸、赖氨酸），如图4所示，可以使抗体在较低浓度的NaCl下被洗脱，并改善可逆的自聚集 (Reversible Self-Association, RSA) ，降低第二个峰。这表明在CEX的洗脱液中添加带正电荷的氨基酸有助于削弱蛋白结合，并降低蛋白质的构象变化。
图4：Capto SP ImpRes线性梯度洗脱中添加不同氨基酸的洗脱条件和色谱图
也有文献报道[9]，使用CEX纯化IgG1抗体，在上样、洗杂、洗脱阶段添加低浓度精氨酸可以有效降低聚集体的形成，改善双峰问题，同时去除HCP。如图5所示，添加100 mM精氨酸后，洗脱主峰前移，IgG1抗体被更早洗脱，而且第二个峰基本上消失。洗脱液的分析结果如表1所示，对照组的聚集体含量增加了3.2倍，HCP去除效果不明显；添加100 mM精氨酸后，聚集体含量降低了1.9倍，HCP残留量降低了7倍，收率能达到91.3%。该案例也说明精氨酸能减弱蛋白结合，改善蛋白聚集。
图5：利用精氨酸优化CEX的洗脱条件和色谱图
表1：洗脱液的分析结果
案例四
利用精氨酸提高疏水层析的样品纯度和收率
一般聚集体的疏水性比单体要强，对于自身疏水性比较强的抗体，Capto Octyl、Capto Butyl等疏水性比较弱的填料可以作为优先选择，通过筛选一个合适的上样条件，就可以使目标抗体分布在流穿组分中，聚集体结合在填料上，从而实现有效分离。当然，也可以选用Capto Phenyl ImpRes或Phenyl HP高分辨率疏水填料，通过结合洗脱的方式高效去除聚集体，可通过添加乙二醇或精氨酸的方式提高收率。
以Capto Phenyl ImpRes层析线性梯度洗脱为例，结果如图6所示，与对照组相比（纯度98.8%，收率37.8%），使用乙二醇作为洗脱添加剂，样品的SEC纯度为98.2%，收率提高到76.4%；使用精氨酸作为洗脱添加剂，样品的SEC纯度提高到99.6%，收率提高到70%[10]。
图6：Capto Phenyl ImpRes去除聚集体的洗脱条件和色图谱
案例五
利用精氨酸改善多模式层析中洗脱峰的拖尾问题
Capto MMC ImpRes同时具备电荷作用与疏水作用，平均粒径40 μm，小粒径可以带来高分辨率，能有效分离单体和聚集体。图7单抗纯化案例中，聚集体含量为14%，通过Capto MMC ImpRes纯化，在pH 5.5的条件下使用500 mM NaCl线性梯度洗脱，得到了高纯度的单体分子，有效去除了目标产物中的聚集体，不过由于填料本身具备的疏水作用，洗脱峰会有部分拖尾，导致洗脱体积变大，从而降低了样品的浓度。此时改用300 mM精氨酸进行线性梯度洗脱，能在保障分辨率的前提下缩小洗脱体积[11]。这是因为精氨酸可以与样品竞争性结合带负电的MMC配基，并产生空间位阻效应，减弱电荷相互作用和疏水相互作用。
图7：Capto MMC ImpRes去除聚集体（A-NaCl线性梯度洗脱，B-精氨酸线性梯度洗脱）
在另一案例中，利用Capto MMC ImpRes可有效去除双特异性抗体 (bispecific antibody, BsAb) 中的半抗 (half antibody) 、同源二聚体 (homodimer) 和聚集体等杂质。结果如图8所示，在pH 5.5的上样条件下，发现homodimer结合能力强于half antibody，但略弱于目标BsAb，通过优化淋洗条件，增加Wash 2和Wash 3两步淋洗，可有效去除half antibody和homodimer，再进一步提高盐浓度洗脱目标BsAb。由于聚集体结合更紧密，采用50 mM NaAc-HAc，500 mM Arg-HCl，pH 5.5的strip条件，可以高效去除聚集体，峰形尖锐，没有拖尾现象。通过优化淋洗步骤和洗脱条件，经HPLC分析之后，目标产物SEC纯度从73.3%提高到了99.0%[12]。
图8：Capto MMC ImpRes去除BsAb中副产物的层析条件和色谱图
总结
精氨酸通过多种作用机制（包括静电、氢键、疏水、阳离子-π等相互作用）影响蛋白质的重折叠、聚集、溶解和纯化过程，从而在抗体工艺开发中发挥重要作用，助力获得低聚集体、低HCP、高回收率及高纯度的产品。
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参考文献
