众所周知，培养基中原材料的变异性会对细胞培养产生重大影响。如细胞生长、产量以及更重要的产物的最终质量属性。变异性的来源包括杂质、配方错误、污染物和化学降解。其中，金属离子作为参与各类酶催化反应的重要辅因子，当其作为杂质形式存在时，对细胞表现和产物质量属性的影响最为显著。
Biogen公司用ICP-MS（Inductively coupled plasma-Mass Spectrometry，电感耦合等离子体-质谱）分析平台的上游培养原材料[1]CDM（Chemical Defined Medium，化学成分限定培养基）、氨基酸、无机物、有机物、水解物和血清中的金属离子杂质种类和含量分布。其中，CDM中金属离子杂质较少，主要有钴、铁和锌（表1）。而水解物因其自身特性（非化学成分限定、来源、产地、年份、土壤影响），金属离子杂质种类较多且含量较高（表3）。
表1：CDM中金属离子种类和浓度分布
表2：有机物和氨基酸中金属离子种类和浓度分布
表3：无机物、水解物和血清中金属离子种类和浓度分布
以铜、铁离子为例，铜离子是细胞有氧代谢路径中许多酶的辅因子，适当的铜离子可促进细胞乳酸代谢，提高抗体表达量。但同时，铜离子是羧肽酶B的辅因子-锌离子的竞争性抑制剂，过高的铜离子会导致抗体产生较多的碱性异构体。此外，过高的铁离子浓度会催化细胞产生大量的ROS（Reactive Oxygen Species，活性氧簇），而ROS引起细胞氧化应激后会使抗体蛋白发生降解[2]。
因此，细胞培养环境中金属离子浓度需要进行严格控制以保证合格的终产物质量属性。以下是一篇Christine H等人进行的研究，详细阐述培养基组分-铁供体中较高的金属离子杂质对细胞生长、产量和蛋白的质量属性影响。
材料与方法
细胞1&2：CHO K1、生产IgG1、mAb1、mAb2；细胞3：CHOZN、生产融合蛋白；
培养基：无铁离子培养基；
铁离子供体试剂：柠檬酸铁铵 (FAC) 、柠檬酸铁 (FC) ；
杂质分析：ICP-MS分析两种铁离子供体试剂中的金属离子杂质。
结果
表4：FAC和FC中的杂质种类和含量 (＞3μg/g)
B：硼、Mg：镁、Al：铝、K：钾、Ca：钙、Ti：钛、V：钒、Cr：铬、Mn：锰、Co：钴、Ni：镍、Cu：铜、Zn：锌、Ga：镓
硼和钾离子杂质在FC中浓度高于FAC；
镁、铝、钙、钛、钒、钴、铜、锌、镓离子杂质仅在FAC中检测出，FC中几乎无。
锰、铬、镍离子杂质在FAC的含量也高于FC，其中FAC中的锰离子杂质贡献了培养基中94%的锰杂质占比。
锰离子是参与糖基化的重要调控因子，锰离子浓度与末端半乳糖基化成正相关性。这也是造成先前研究中随着在无铁离子培养基中加入2~100 mg/L的FAC，末端半乳糖基化水平逐步升高的原因（详见原文）。在后续研究中，因无法找到极低锰离子杂质的FAC，换以FC为模型，来研究高低两种锰离子杂质对细胞生长和产物质量属性的影响。其中FC中锰离子浓度较高的组命名为FCPurch (530 μg Mn/g) ，较低的组命名为FCSynt (0.36 μg Mn/g) ，此外还有三组在FCSynt中额外弥补锰离子以达到FCPurch相同锰离子浓度，命名为FCSynt+Mn2+。
图1：FC中不同锰离子杂质含量对细胞1生产抗体聚集体和糖基化的影响。
(a) 归一化后活细胞密度；(b) 活率；(c) 归一化后产量；(d) 高聚物和主峰；(e) N-糖基化分布
在细胞1生产IgG实验中，FCPurch组的活细胞密度比FCSynt组更高，FCSynt+Mn2+组的细胞可以达到与FCPurch组相似的活细胞密度表现（图1a）。此外，多数FCPurch和FCSynt+Mn2+组的后期活率和产量表现也优于FCSynt组（图1b，c）。mAb1的高聚物含量均低于5.5%，主峰含量均超过94.5%（图1d）。糖型结果显示，无论锰离子是以杂质或添加剂形式存在于培养基中，均会显著提高产物的末端半乳糖基化水平（图1e）。
图2：高低锰离子含量的FC对细胞2和细胞株3培养的影响。
细胞株2 (a) 归一化后活细胞密度；(b) 活率；(c) 归一化后IgG的产量。细胞株3；(d) 归一化后活细胞密度；(e) 活率；(f) 归一化后融合蛋白的产量
在细胞2生产IgG的实验中，10 mg Fe/L FCPurch和FCSynt+Mn2+活细胞密度峰值和细胞活率略高于FCSynt，2 mg Fe/L浓度的组间的活细胞密度无明显差异（图2a，b）。在产量方面，10 mg Fe/L的组别的IgG产量比2 mg Fe/L的组别高出18%左右（图2c）。
在细胞3生产融合蛋白的实验中，FCPurch和FCSynt+Mn2+的活细胞密度峰值比FCSynt高32%和9%，细胞活率也呈现相同的趋势（图2d，e）。此外，FCPurch和FCSynt+Mn2+的融合蛋白产量也高于FCSynt。
图3：mAb2和融合蛋白的糖型分布
FCPurch和FCSynt+Mn2+的抗体分子mAb2的半乳糖基化水平比FCSynt的高出13%，2 mg Fe/L和10 mg Fe/L的FCSynt的半乳糖基化水平分别在14.8%和9.8%（图3a），与mAb1表现相似。融合蛋白中，FCPurch存在的高锰离子对末端唾液酸化和半乳糖基化水平的提升均明显高于FCSynt。此外，随着FCSynt的添加浓度从10增加到50 mg Fe/L，末端唾液酸化水平降低了8%，半乳糖基化提高6.2%。这与mAb1和mAb2的糖型分布相异（图3b）。
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参考文献
