目前在生物制药领域面临的一个挑战:随着蛋白浓度的增加,蛋白分子与小分子(辅料)间的相互作用可能会造成辅料浓度和pH的漂移,这会使得超滤 (Ultrafiltration,UF) 和渗滤 (Diafiltration,DF) 操作后更难达到目标处方条件。通常是由下图所示的道南效应和体积排阻效应造成了辅料浓度和pH的漂移。
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道南效应:大分子mAb被截留后会在UF/DF膜回流端形成带电大分子的聚集,而膜回流端和透过端必须保持电中性和化学势的平衡。以常规碱性pI的mAb在pH 6.0左右的制剂缓冲液中带正电为例,此时溶液中带正电的His+和H+被排斥,带负电的Cl-和OH-被吸引,最终造成回流端产品中His+和H+浓度降低而Cl-浓度升高,pH升高。
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体积排阻效应:随着被截留mAb浓度的升高,蛋白分子在整体溶液中占据的体积逐渐提高,其他溶剂和小分子所能占据的体积就会减少,即被排阻至透过端。
Sourcing:Strategies for high‐concentration drug substance manufacturing to facilitate subcutaneous administration: A review
道南效应会影响渗滤过程中缓冲液的置换效率,起始缓冲液与目的蛋白带有相同种类电荷会增强之间的互斥作用,提高渗滤置换效率,反之则降低渗滤置换效率;同时蛋白浓度亦会影响渗滤置换效率,高浓度其置换效率要比低浓度更低。这为超滤浓缩过程中选择合适的置换浓度提供了理论上的支撑。
TestSourcing:Accounting for the Donnan effect in diafiltration optimization for high‐concentration UFDF applications
漂移补偿策略降低影响
道南效应造成的产品辅料浓度和pH的变化,可以通过优化调整置换缓冲液的带电性质和辅料的浓度加以缓解。通过寻找合适的蛋白浓度或者进行漂移补偿去减缓这种影响。下图是以蔗糖为例子,但该方法也适用于其他辅料和pH值。具体操作如下:
以目标制剂作为DF缓冲液,进行UF/DF实验,根据单克隆抗体 (mAb) 浓度确定pH值和辅料水平。
对数据进行拟合,以确定目标UF2 mAb浓度下的pH值或辅料排除量。
使用新的DF缓冲液进行实验,确认结果是否符合目标成分。
Sourcing:Strategies for high‐concentration drug substance manufacturing to facilitate subcutaneous administration: A review
通过如下的例子加以理解:
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当预制备~80 g/L pH 6.0,10 mM组氨酸的单抗产品时需要使用pH 5.9,11 mM组氨酸缓冲液进行最终的置换;
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当预制备~150 g/L pH 6.0,10 mM组氨酸的单抗产品时需要使用pH 5.8,14 mM组氨酸缓冲液进行最终的置换。
缓冲液平衡策略降低影响
当然还可以采用缓冲液平均策略去降低道南效应的影响。具体操作如下:
即采用目标辅料浓度和pH条件下制备DF缓冲液。
通过上述偏移模型预估偏离度并通过实验加以验证。
然后使用组分调整的缓冲液去进行产品的回收(顶洗)操作。最终通过综合顶洗缓冲液的pH和辅料浓度的调整达到实现目标处方的要求。
通过如下的例子加以理解:
当预制备~120 g/L,pH 6.0,10 mM组氨酸的单抗产品时,当过浓缩的产品浓度为150 g/L时,料液的组氨酸组分只有7 mM左右,如果过浓缩料液体积为90 L时,此时需要采用10 L组氨酸浓度为37 mM的顶洗缓冲液才能最终达到终浓度为10 mM的组氨酸浓度。
Cytiva SPTFF技术降低影响
如前文所述在较高的蛋白浓度下道南效应带来的影响是可观的。
为了降低这种影响,除了前述的漂移补偿和缓冲液平衡的策略,采用SPTFF技术也是一个有效的缓解策略。首先将蛋白产品在一个合适蛋白浓度下完成浓缩和换液(通常50 g/L),然后采用SPTFF技术实现进一步的浓缩,最终实现高度浓缩的目的。
以下为Cytiva SPTFF示意图,通过膜包之间的串联以实现流道长度增加;通过降低进料流速来增加停留时间,结合这两种策略可以实现最终的高浓度产品的目标。
Cytiva SPTFF可以实现产品单向流和单次流的效果,减少产品与膜包的接触时间,减少工艺时间,提升工艺效率。
下图所示在初始浓度为50 g/L时采用不同的层级可以实现不同的最终产品浓度。
Cytiva在大量实验和经验总结的基础上为客户提供了一个SPTFF膜包级数的参考建议,客户可以在推荐基础上进行尝试和调整。
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