近年来，DNA疫苗和基因治疗作为通过基因转移预防或治疗疾病的新方法引起了人们的广泛关注。DNA疫苗比减毒等经典疫苗更安全、更有效。与病毒载体相比，pDNA等非病毒载体因其安全性、通用性、制备方便以及不诱导免疫原性等优点而更具吸引力。
质粒DNA (pDNA) 的生产和纯化挑战
质粒通常在大肠杆菌中产生，并通过一系列纯化工艺进行制备。生产和纯化的过程往往导致产生其他同源异构体杂质，如oc（开环）、线性和变性pDNA。如果切割或链融化破坏启动子或基因编码区，那么产生的同种异构体在诱导完整的免疫反应方面不如sc同种异构体有效。因此，分离sc（超螺旋）型pDNA是大规模纯化用于DNA疫苗和基因治疗的pDNA载体的关键步骤。
目前已有多种层析方式用于纯化pDNA，比如阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等。这些方法可以很好地去除宿主污染物（蛋白质、RNA、内毒素、基因组DNA等），但它们通常使用两步或更多的色谱步骤，这将增加成本并降低回收率。
如何建立一种经济高效的pDNA纯化工艺，用于基因治疗和DNA疫苗的大规模生产，显得尤为重要。本文作者通过选择合适的HIC柱，并改进上样方法和洗脱方法，从sc pDNA中去除oc pDNA，使得质粒纯化更简单高效。
接下来，让我们一起来看看作者是怎么做的吧！
实验材料与方法
首先将携带质粒的大肠杆菌DH5α在含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，收获处于对数后期的细菌，并用OMEGA质粒试剂盒纯化1 mL培养物中的pDNA作为对照。
采用碱裂解法裂解细菌，离心后弃上清，重悬细菌沉淀，进行碱裂解和中和，离心去除沉淀，将中和后的裂解液分成三份，分别加入固体硫酸铵使其浓度达到2 M、2.5 M和3 M，溶解后孵育并离心，上清液过滤后直接加载到HIC柱上。
用Octyl Sepharose 4 Fast Flow吸附剂填充XK 16/40柱，使用不同浓度的硫酸铵 (2 M、2.5 M、3 M) 作为平衡缓冲液，洗脱缓冲液为1 M硫酸铵，流速为400 cm/h，对质粒样品进行色谱分析。
使用Sephadex G - 25柱对质粒样品进行脱盐。具体层析工艺路线如下图所示：
图1：纯化流程图
质粒质量检测
为了检测该方式纯化的质粒的均一性、纯度、内毒素及活性等指标，作者采用了一系列的检测手段进行验证。
首先对HIC样品进行电泳分析，检测pDNA的均一性。结果如图2所示：
图2：琼脂糖凝胶电泳检测质粒均一性
琼脂糖凝胶电泳显示，无论使用何种方法，质粒产物中均无基因组DNA和RNA，当盐浓度为3 M时，质粒DNA的超螺旋百分比为98 ± 1.2%，纯度较高。
接着通过阴离子交换HPLC测定质粒纯度，结果如图3所示：
图3：HPLC分析质粒纯度
（A：2 M盐离子浓度下的质粒；B：2.5 M盐离子浓度下的质粒；C：3 M盐离子浓度下的质粒）
HPLC分析证明当盐浓度为3 M时杂质未检测到；蛋白质污染物未检测到，内毒素水平低于0.003 EU/µg pDNA，A260/A280比值为1.91 ± 0.05。
最后，作者通过脂质体转染实验检测质粒的生物活性。结果如图4所示：
图4：脂质体转染分析质粒转染活性
（A：OMEGA kit提取的质粒；B：3 M盐离子浓度下的质粒）
体外转染实验表明，本文纯化的pDNA（使用3 M硫酸铵）比对照pDNA具有更高的转染效率，3 M纯化的pDNA转染效率为33.6 ± 0.7%，对照pDNA为28.4 ± 0.5%。
结果与讨论
本研究中制备的pDNA纯度高，超螺旋百分比为98 ± 1.2%，无残留内毒素、基因组DNA、RNA和蛋白质，且转染效率更高，满足制药级pDNA生产的主要要求，易于从实验室规模制备转移到大规模生产。
本文作者在实验过程中，使用了Cytiva公司的Octyl Sepharose 4 Fast Flow疏水填料、PD-10 脱盐层析柱以及XK 16/40层析空柱。同时使用了Cytiva的层析系统ÄKTA Purifier。
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参考文献：
H. Bo et al. Using a single hydrophobic-interaction chromatography to purify pharmaceutical-grade supercoiled plasmid DNA from other isoforms. J.Pharmaceutical Biology, 2013; 51(1): 42–48
