外泌体 (Exosomes) 是直径约为30–150 nm[3]的细胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs) ，为脂双层结构的纳米颗粒，几乎所有细胞都可以产生，具有异质性，参与细胞之间的通讯交流及各种生理过程，并用来运载蛋白、脂质和核酸等生物活性物质至受体细胞。外泌体具有生物相容性甚至跨越生理屏障（如血脑屏障）[1]。因此，被广泛研究和开发，用于治疗、诊断和药物/基因递送[2]。
文末有惊喜！
图1：外泌体分子组成示意图[3]
根据BCC Research的研究报告，全球市场上外泌体作为诊断、治疗和研究工具，将从2023年的2.275亿美元，预计到2028年增长至13亿美元，即5年内的年复合增长率高达42.4%[4]。随着外泌体更多地出现在临床试验中，其工艺放大生产仍然是面临的主要挑战之一。外泌体通常从细胞上清或体液中分离，根据不同的应用需求，可以选择超速离心、沉淀、超滤、分子筛、亲和层析[5-9]、磁珠、微流控等[10]。在研发、方法开发以及诊断应用方法中，超高速离心最为常用，但是存在明显弊端如形态破坏且不利于放大。随着研究深入，分子筛成为第二大主流方法[11,12]。
图2：外泌体分离的不同方法比较，来自357份样本[12]
SEC vs Capto Core技术
本期智荟专线将为大家重点解读，分子筛和Capto Core技术在外泌体纯化工艺中的较量，剧情跌宕。
分子筛 (Size Exclusion Chromatography, SEC) 依据样品大小和形状进行分离，大分子先出峰。操作简单、温和，纯化后的外泌体结构完整具有功能[13]。随着临床研究及工业放大，需要通过生物反应器进行外泌体大量生产，也意味着要从更大量的杂质（如蛋白、核酸和脂蛋白）中分离外泌体，对纯化造成挑战。SEC本身的低流速和体积限制上样方式，也是其放大瓶颈。
图3：使用分子筛进行外泌体纯化流程[13]
使用ÄKTA Pure层析系统以及分子筛层析柱进行外泌体纯化，由于样品被稀释，需要进行后续浓缩、低温保存
Capto Core (CC) 作为复合模式层析，最初设计用于病毒颗粒的纯化，其外面包裹一层5 μm厚度的钝化外壳（无配基），大分子样品被排阻而流穿，小分子杂质通过外壳孔隙进入填料内部从而被辛胺配基（疏水及阴离子作用）捕获，通过CIP清洁再生去除结合的杂质。由于外泌体传统分离方法的各种弊端，Capto Core技术被逐渐开发并成功用于细胞2D大量培养下[14]以及体液（如血浆）中外泌体的纯化[15,16]。Capto Core优势：
高流速：Capto高刚性骨架，流速压力性能更好，工艺流速空间更大。
高上样体积：由于杂质吸附，上样量不受体积的限制，不需要预先浓缩以减少体积。或者相比SEC，可以装更小体积的柱子，利于放大。稀释效应也低于传统SEC。
高结合载量：穿透模式，载量更高。
操作条件温和（耐受广泛的pH和盐浓度），收获的样品完整、有活性。
图4：Capto Core填料包含一个5 μm的钝化外壳以及核心中的辛胺配基[17]，可以有效排阻大分子样品
目前，最典型的工艺方案是，先使用离心或过滤等方法去除细胞碎片及更大的颗粒→TFF超滤浓缩换液并去除大部分杂质→通过Capto Core层析去除剩余小分子杂质，也可以加一步精纯（如离子交换或亲和）[18]。Capto Core 700（平均排阻700 kDa）和400（平均排阻400 kDa）均可以用于外泌体纯化测试，使用CD81-mCherry细胞株的外泌体 (30–150 nm) 进行平行对比实验显示，Capto Core 400的收率更高，而Capto Core 700的纯度更高[17]。
分子筛和Capto Core的第一轮较量
为了探索大规模生产条件下的外泌体纯化，2024年1月，Scott E. Bonner等发表文章[19]，深入地研究了Capto Core 700 (CC 700) 新工艺方案和普通分子筛Sepharose 4 FF对于3D生物反应器生产外泌体的分离差异。使用3D中空纤维生物反应器进行HEK293T细胞 (ATCC) 培养，收获条件培养基（上清），离心去除细胞碎片后分为两等份，按照表1的方法进行预处理和分离。
表1：使用Capto Core 700和Sepharose 4 FF进行HEK293外泌体纯化的方案设计及结果差异
层析图谱如图5所示，虽然普通SEC对于常规2D培养表现出良好的分离效果（图5，a所示），但是在3D放大培养条件下（图5，b，Run 1），由于外泌体及杂质含量增加，SEC无法有效分离EVs（洗脱峰a）和杂质（洗脱峰b）。继续优化，如对洗脱峰a进行再次SEC纯化，在第三次纯化（图5，b，Run 3）洗脱时可达到基线分离，但损失了收率且费时。其实，也可以通过降低初始上样量run多个cycles进行优化，但会影响工艺效率。
图5：使用分子筛及复合模式填料纯化外泌体层析图谱（Sepharose 4 FF对普通2D）
(a) 以及3D中空纤维反应器 (b) 培养条件下生产的外泌体进行纯化，层析图谱b中run2、run3代表将run1和run 2的洗脱液分别再次上柱。使用Capto Core 700对3D中空纤维反应器 (e) 条件下的外泌体进行纯化的典型层析图谱。截取自参考文献[19]
注意：
这里使用的分子筛4 FF并不具有最高分辨率和流速，仅为常规对照（Cytiva有新品供应）。
图5中e为3D条件下，Capto Core 700的层析结果图，整个穿透峰即为纯化的EVs，拖尾体现出轻微的分子筛效应，单次运行即可达到较高的纯度。在2D培养条件下，与分子筛相比，二者纯度相当但Capto Core 700获得的颗粒数（浓度）更高，重复性更好。因此，对于外泌体的纯化，Capto Core可以作为SEC的有效和可放大性的替代产品。
故事到这里并没有结束…..
剧情推进-SuperSEC新品
Cytiva不断自我超越，创新不止。2024年4月，Cytiva在全球上市superSEC填料，专门为使用分子筛进行生物大分子的大规模纯化而设计，如外泌体、包膜病毒、质粒和mRNA等。superSEC为改良的高度交联琼脂糖骨架，具有更优越的流速压力性能，平均粒径75 μm，替代研发级别的Sepharose CL-2B（粒径分布60~200 μm）。主要特征[21]：
可放大性强：对生物大分子进行生产级别的高效纯化。
高流速：流速高达300 cm/h（20 cm柱高，<200 kPa），操作空间大，工艺设计更加灵活。与CL-2B相比，在同样柱型条件下，运行时间更短，生产效率更高。
化学稳定性强：CIP清洁耐受1 M NaOH、2 M NaCl、70% ethanol等。
蛋白线性分离范围：5×10^4~5×10^6 Da。Latex颗粒分离范围约50~70 nm（与CL-2B相当）。
图6：Cytiva superSEC resin及常用分子筛填料的选择性曲线图
superSEC填料的选择性曲线的斜率和sepharose 4FF以及Sepharose CL-2B基本一致，三者分离范围有差异[21]
新产品superSEC测试案例中[22]，三种不同细胞系（hMSC、HEK293及CAP细胞）的前处理一致。上游培养规模10 L (titer：10^9-10^11 particles/mL) ，收集上清液，并离心 (2500 g, 10 min) 去除细胞碎片。取250 mL样品，使用ÄKTA Flux S超滤系统及750 KDa TFF膜柱 (Cytiva UFP-750-E-H42LA, 73 cm2) 进行超滤 (TMP 0.4 bar) ，先进行10X浓缩及5X洗滤换液至PBS pH 7.4中，加入核酸酶Benzonase (2 kU +1 mM MgCl2) 孵育2小时降解DNA，再次进行10X洗滤进一步去除HCP和降解后的HCD。取样，进行分子筛测试。
图7：分子筛superSEC用于细胞上清中外泌体纯化的工艺流程
在hMSCs (RoosterBio) 细胞测试中，将superSEC和Sepharose CL-2B分别装填到Tricorn 10/200柱中（柱高BH=20 cm，17 mL柱体积），均上样0.125 CV（柱体积）。由于骨架差异，二者分别使用38 cm/h（运行时间50 min）以及11 cm/h（运行时间150 min）的线性流速。结果如图8所示，NTA分析显示左侧出峰 (F3) 主要是hMSC外泌体，右侧的峰 (F5) 则主要是蛋白等杂质（BCA检测），两种填料均体现出良好的分辨率（superSEC的颗粒数/杂质含量稍微更高），且收率相似（超过50%）。显然，superSEC的高流速性能使得其运行时间更短，工艺效率更高。
图8：使用superSEC及Sepharose CL-2B（Tricorn 10/200层析柱）纯化hMSC外泌体的层析图谱（左侧）以及分段收集液 (F=4 mL) 中的外泌体颗粒密度和蛋白含量（右侧）[22]
将superSEC工艺继续线性放大到HiScale 26/40层析柱上，维持柱高20 cm，106 mL柱体积（6 X放大）。线性流速基本不变34 cm/h，运行时间仍然为50 min。层析结果被成功放大，TEM检测形态正常、WB检测特征蛋白阳性。之后，使用HEK293以及Cytiva’s amniocyte production cells (CAP) 细胞株进行测试，经过类似的工艺流程，都证明了superSEC的有效性和可放大性。
后续，针对Cytiva CAP表达外泌体，使用1根4.7 mL的Hiscreen Capto Core 700（前述superSEC为两根串联）进行对照实验，维持上样总体积 (1 mL) 不变，相当于多上了一倍的样品。结果显示，Capto Core 700的外泌体收率 (64%) 比superSEC更高 (56%) ，但是纯度稍低于superSEC，这也和上样量以及收峰策略有关。此外，Capto Core 700可以处理更大体积样品，甚至是未处理的细胞上清。
第二轮较量：孰优劣？并举
故事讲到这里，我们以superSEC作为SEC的新型代表，补充改写分子筛与Capto Core技术对于外泌体分离的差异。
表2：Capto Core技术和SuperSEC分子筛对于外泌体纯化的比较
+：优势，-：劣势
总之，superSEC是对Capto Core复合模式工艺的良好补充。那么3D反应器条件下的外泌体纯化，是否也有比较数据呢？
superSEC和Capto Core 400
反应器对比数据
2024年5月，在第30届国际细胞与基因治疗学会年会 (ISCT) 上，RoosterBio, Inc. 与Cytiva US合作发表会议摘要：A comparability study of chromatography resins suitable for EV purification from a highly productive MSC bioprocessing platform（高产量MSC工艺平台中适于EV纯化填料的可比性研究）[23]。报告中直接比较了Capto Core 400和superSEC对于外泌体纯化的效果。研究中使用骨髓来源hMSC (RoosterVial-hBM MSCs) ，通过生物反应器 (Bioreactor) 进行放大培养。收获上清 (9.1E9 EVs/ml) ，经过离心及TFF超滤后，分别上样到Capto Core 400和SuperSEC层析柱上。主要结果：
收率：Capto Core 400为97%，SuperSEC为89%，即复合模式稍高。
纯度：收获液中，样品纯度为9E+10 particles/mg蛋白。Capto Core 400纯化后为6E+11 particles/mg蛋白，SuperSEC纯化后为1.4E+12 particles/mg蛋白，分子筛稍高。Capto Core 400相对更高的收率和稍低纯度，与前面2D条件下，Capto Core 700和superSEC对比结论一致。
四次跨膜蛋白：纯化后的外泌体维持了CD63, CD9和CD81阳性。
该实验数据再一次证实，在放大工艺产生的高浓度外泌体纯化中，Capto Core以及superSEC都表现出可靠的外泌体收率和纯度，有力地去除了杂质，二者均可以作为外泌体工艺放大纯化的有利工具。作为平台搭建，建议二者俱备。
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表3：superSEC订购信息
可定制ReadyToProcess 一次性使用预填充层析柱[21]
表4：复合模式填料Capto Core订购信息[24]
相关阅读：
☞ 外泌体纯化和 Capto Core 700 的不解之缘
☞ 外泌体纯化之中空纤维应用案例
参考文献
