寡核苷酸药物（Oligonucleotide drug，又名小核酸药物）药物机理为直接作用于疾病的遗传物质 (DNA/RNA) 靶点发挥治疗作用，因其具有设计简便、研发周期短、靶点丰富、特异性强、药效持久等独特优势，被誉为继抗体后的第三代创新药。中国的小核酸药物近年来发展迅速，潜力巨大，目前，中国在开发的小核酸管线数量总数超过345条（其中118条为gRNA等管线）80%以上的中国在研管线还处于临床早期。
寡核苷酸药物常用的合成方法为固相亚磷酰胺法也称为固相合成方法。而在固相合成过程中，合成载体起了重要的作用。固相合成载体按载体性质和特征主要分为两大类：可控微孔玻璃 (CPG) 和聚苯乙烯 (PS) 。前者具有良好刚性、不溶胀、可控孔径等优点，但是由于CPG很难做到高的负载量（通常<100 μmol/g），通常在目前主要应用于gRNA合成、引物合成、检测探针合成和早期药物筛选。PS载体具有高负载量 (350 μmol/g) 的优点，可以适用于大部分的核酸序列。
CPG球孔结构
PS显微镜下微球结构
在以往的载体选择中，通常选择的首要指标是合成后的粗品纯度、目标产品收率以及杂质等情况，载体本身有哪些特性会影响上述指标的表现呢？以下就PS载体与大家探讨一款好的合成载体应具有的优势：
01
不同试剂的稳定性
除了最初与Linker结构发生键合（即载体的功能化）以外，固相载体本身不应该在随后的合成反应中参与合成或者受到合成过程中的溶剂影响。固相合成通常分为四个步骤：脱保护->活化与偶联->氧化/硫化->盖帽，在合成过程中会涉及到多种溶剂，常见的包含：脱保护试剂二氯乙酸 (DCA) 甲苯溶液或者二氯甲烷溶液、乙腈 (ACN) 溶液、氧化试剂溶于吡啶溶剂、活化试剂 (BTT) 、DEA溶液（二乙胺）等。由于在合成过程中，每一个碱基都在不同的溶剂中切换，因而载体本身在不同溶剂中的稳定性很重要。
图示1：寡核苷酸合成的四个步骤与核酸合成在不同溶剂中的变化
02
不同试剂间的溶胀差异
对于PS树脂，在乙腈和甲苯以及乙腈与氧代试剂的切换过程中，溶胀系数变化对于合成结果也很重要，如果在合成过程中切换不同溶剂间的溶胀系数差异过大，会造成合成中压力的瞬时上升，影响合成结果。
图示2：载体在寡核苷酸合成步骤中接触到不同溶剂的变化
03
粒径分布均一且适宜
在固相合成中，容纳载体的合成柱的筛板大部分在10 um左右，载体的粒径分布需要均一。粒径过小，容易卡在固相合成的筛板处，造成合成过程中压力上升。粒径过大导致单位质量体积增加，比表面积减小影响载体本身在合成柱中的装填量，影响单柱的产出。除了合适的粒径，粒径分布也需要均一。粒径分布偏差大，过于分散，会在载体溶胀过程中造成小粒径的球体卡在大球之间的缝隙中，造成合成过程中的压力上升现象，影响最终合成的结果。（当然合成过程中压力变化有很多因素导致，不一定完全由粒径大小和粒径分布导致，需要具体问题具体分析。）
04
良好的刚性结构
载体本身应该具备一定的机械强度，在寡核苷酸合成过程中，不同载体之间由于试剂的切换和载体本身在不同试剂中的溶胀变化会造成载体之间的挤压和摩擦，同时随着合成反应的进行，载体与偶联在载体上的目标物逐渐涨大，会逐渐充满合成柱的上下筛板。载体本身的机械强度对于合成结果有直接的影响：摩擦和挤压如果造成载体的破碎会影响最终的合成结果。
图示3：载体合成过程中随着时间推移，柱床高度变化
05
合适的基团密度/分布与合适的装填系数的结合
一款载体本身的载量会影响最终的合成效率，在同样或者接近的装填密度下，在合成过程中高的载量会带来高的合成产出。然而合成载量并非越高越好，高的载体载量通常会带来合成过程中更高的空间位阻，影响最终的目标序列的合成。当然如果载体可以满足其他以上提到的优良性质，可以考虑在同样的装填系数下选择高载量的载体。
06
装填系数的摸索
一款好的载体除了以上因素外，载体开发者应摸索出适合载体的合适装填系数。载体装填系数偏低，单柱的合成的目标序列降低，降低了合成效率，增加了合成成本。装填系数过高，容易造成合成过程中最后几个碱基合成的超压，影响目标序列的最终步骤的合成。
图4：基于寡核苷酸长度利用Primer Support 5G进行合成的装柱密度建议
07
批次间的稳定性
优质载体供应商应具有较好的批量生产能力。小规模的样品制备所达到的载体的载量、溶胀、粒径大小、粒径分布、孔径大小等指标应在放大生产的过程中可以重现同样的产品质量。
08
支持长链的合成
PS树脂由于高载量，与CPG相比对于合成长链有更大的空间位阻。而现在CPG载体由于载量低，合成过程中容易破碎等问题，对于长链合成的产出造成了一定的影响。尤其对于后续的放大生产而言，由于载体破碎和载量较低会造成合成成本的上升。PS树脂的载量较高，合成中相对不易破碎，部分优质载体可以支持长链合成。不同偶联效率对于长链核酸合成的得率影响很大。
图5：不同耦联效率下的FLP得率
Cytiva PS5G第五代固相载体
高效合成寡核苷酸
Primer Support 5G（简称PS5G）是来自Cytiva用于合成寡核苷酸的第五代固相载体。PS5G在不同试剂中产品表现稳定，批次间稳定性好，支持优化合成长度达70个碱基（总部合成实验中，支持了84nt序列的DNA合成）的DNA和RNA寡核苷酸。载体的基本粒子由交联聚苯乙烯组成，具有较高的粗纯度和合成收率。
该产品优势：
高载量：对于DNA和RNA寡核苷酸的合成，DNA和RNA的载量分别为350 umol/g和300 umol/g；
合成成本低：高载量、低杂质，节省了合成时间，提升了合成效率；
易于放大：Primer Support 5G 固相载体具有从科研到工业规模的卓越可放大性；
提供定制服务：Cytiva为DNA和RNA提供定制的固相载体服务，可以使用几乎任何您选择的分子；
支持长链合成：这种载体支持优化合成长度达70个碱基（总部合成实验中，支持了84nt序列的DNA合成）的DNA和RNA寡核苷酸。
年底收官大促
