撰文：Vergil，高田生物
编辑：RNAScript，高田生物
排版：三姐夫
脂质纳米颗粒（LNPs）作为基因递送的非病毒载体，已经得到了广泛的应用。通常我们从粒径、多分散指数（PDI）以及mRNA包封率等理化性质表征LNP。根据脂质配方和制备方法的不同，LNP可能具有高度异质性，其不同的结构特征如何影响mRNA-LNP疫苗的活性尚未得到充分研究。
2024年11月12日，杭州高田生物吴钪锃博士等研究人员在药剂学顶级期刊Journal of Controlled Release上发表了针对LNP结构研究的论文：“Characterization of mRNA-LNP structural features and mechanisms for enhanced mRNA vaccine immunogenicity”。在这项研究中，研究团队制备了具有典型结构的三种LNP：乳液状LNPs（emulsion-like LNPs，eLNPs）、富膜结构LNP（membrane-rich LNPs，mLNPs）以及常规泡结构LNP（Classic “bleb” structure LNPs，cLNPs）。体内外研究结果显示，不同结构LNP的体内外活性和免疫原性表现不尽相同。
三类LNP的表征
使用不同的配方制备LNP，并表征得到其大小分布、zeta电位和mRNA包封效率（表1），冷冻电镜图像显示了三种LNP具有不同结构特征（图1）。简单而言，eLNPs的内部具有一个油状核心而其表面具有斑块状的膜状结构；mLNP的内部则充满了膜状结构；而经典配方的cLNP内部则包括一个高密度区域以及一个低密度的泡状区域，同时包含了eLNPs和mLNPs的部分特征。
通过检查体外多次冻融循环后LNP粒径和mRNA包封效率的变化来评估不同LNP的稳定性。结果表明，与eLNPs和cLNPs相比，mLNPs是最稳定的。
图1. 三种LNP的冷冻电镜图
表面脂质组成的表征
使用荧光探针对甲苯胺基萘-2-磺酸盐（TNS）添加到LNP悬浮液中，以估计LNP表面的正电荷量，荧光强度越高，表面可电离脂质TM6的含量也越高（图2A）。虽然三种LNP配方中的TM6总量相同，但不同的TNS强度表明LNP表面TM6含量不同（图2B）。eLNP荧光与cLNP相似，但低于mLNP。这可能是因为eLNP和cLNP都具有较大的脂质核心。
荧光探针NBD-DPPE具有类似于DSPC的两亲性，连二亚硫酸盐可淬灭荧光，根据荧光比率可估计表面与内部DSPC的含量（图2C,D）。令人惊讶的是，在mLNP和cLNP样品中，只有不到15%的NBD-DPPE荧光被淬灭，这表明很大一部分DSPC脂质可能位于LNP的内部膜结构中（图2E）。
综上所述，研究表明mLNP表面的可电离脂质含量更高，而eLNP表面的DSPC含量更高。
图2. LNP表面脂质荧光探针分析
不同LNP的体内外表达及免疫原性分析
体外转染差异
在293T细胞系中，随时间变化的蛋白质表达谱在三种LNPs之间显著不同（图3A）。cLNPs在大约10h时达到最高的基因表达水平。mLNPs的蛋白质水平则表现出更慢的持续上升过程，并在48h达到峰值。相比之下，eLNP在整个研究过程中的mRNA表达水平持续较低。观察到的基因表达动力学差异表明，需要针对递送靶细胞和治疗应用优化mRNA的内体逃逸。
此外，将EGFP mRNA-LNPs转染HUH-7肝癌细胞、HUVEC内皮细胞和几种免疫细胞（DC2.4、Jurkat和RAW264.7），所有三种LNP均有效转染人肝癌细胞HUH-7。然而，mLNPs在转染免疫细胞（DC2.4、Jurkat和RAW264.7）方面表现出更好的活性，而eLNPs在转染HUVEC细胞效率很高（图3B）。
图3. 不同LNP的体外转染对比
体内转染差异
小鼠肌肉注射后，mRNA LNP制剂主要在注射部位和肝脏中表达。其中，eLNP和cLNP在注射后1h就在注射部位肌肉细胞表达，eLNP几乎仅在注射部位表达，没有在其他组织中表达。mLNP的表达水平则在6-24h内逐渐增加，并在注射后1小时即转移至肝脏部位表达。
图4. 小鼠肌肉注射不同LNP的荧光表达
同时研究团队也通过注射包载新冠S蛋白RBD mRNA的不同结构LNP，评价诱导的RBD抗体滴度水平。结果显示，相较于mLNP和cLNP，eLNP可以诱导更快、更持久的免疫反应，仅一剂后抗体滴度更高，免疫反应持续时间更长。相比之下，mLNPs效果较差，抗体滴度要低得多。
对比分析
由于mLNP的内部膜结构中含有更多的DSPC，包封的mRNA以多层或管状形式夹在脂质层之间，使mLNPs在物理扰动下更加稳定，可以从注射部位迁移到肝脏和可能的其他组织。在细胞转染研究中，发现mRNA表达的持续时间要长得多（图3）。然而，在基因递送实验中，LNP越稳定，mRNA递送动力学越慢，因此表现为转染效率越低。这些特性可能在其他mRNA递送应用中具有促进作用，但对于mRNA疫苗，反而会引起全身免疫反应和潜在的全身毒性。
eLNP具有和大多数mRNA疫苗的cLNPs相似的脂质核心结构，表现出与mLNP不同的转染机制。eLNP的体内分布比cLNPs更具局部性，能够最大限度减少全身副作用，并且抗原表达更快，能快速促进免疫细胞募集。然而，eLNP在DC、T细胞和巨噬细胞等免疫细胞中的转染不佳，可能限制了工程化免疫细胞或递送肿瘤抗原的应用。
总结
本研究针对三种不同结构LNP的结构特征、稳定性以及体内外生物学性质进行了系统性研究，为mRNA疫苗结构的合理设计提供了理论基础。此外，针对不同类型的mRNA药物，也可以选择更适宜结构的LNP作为递送系统，以获得最佳的药物表现。
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高田生物已经建立了针对不同结构的LNP的处方开发和制剂生产平台，目前并已完成了多款mRNA LNP药物的临床前开发，同时在特定细胞靶向的LNP（tLNP）技术领域已获得突破性进展。公司自研tLNP结构可精准靶向T细胞、B细胞、NK细胞和造血干细胞等特定细胞，在自免和肿瘤等适应症领域展现巨大潜力。
参考资料
Wu K, Xu F, Dai Y, Jin S, Zheng A, Zhang N, Xu Y. Characterization of mRNA-LNP structural features and mechanisms for enhanced mRNA vaccine immunogenicity. J Control Release. 2024 Nov 12;376:1288-1299. doi: 10.1016/j.jconrel.2024.11.007.
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