生物稳定剂“双子星”-蔗糖和海藻糖

企业 2024-11-28 07:35 上海

Part.1 蔗糖和海藻糖简介

蔗糖（Sucrose）是由一个葡萄糖分子和一个果糖分子通过β-1，2糖苷键连接形成的非还原性双糖，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁，广泛存在于各种植物的叶、茎、花、果实与种子等组织中，如甘蔗和甜菜，蔗糖的一般工艺是从原料中提汁、澄清除杂提纯后进行结晶得到。

图1 蔗糖分子结构图

海藻糖（Trehalose）是由两个葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键连接而成的非还原性双糖，通常以二水合物形式存在，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O。目前主流的海藻糖工业化生产方法为酶转化法，即以淀粉为底物，在各种酶的协同作用下，将一定链长的直链淀粉转化为海藻糖。

图2 海藻糖（二水合物）分子结构图

Part.2蔗糖和海藻糖作为生物稳定剂的作用机制

在蛋白类生物制剂中，蔗糖和海藻糖通常用作渗透压调节剂和稳定剂。蛋白的稳定是指维持蛋白质结构（构象稳定性）和抵抗聚集的能力（胶体稳定性）。

液体制剂

在液体制剂中，蔗糖和海藻糖通过优先水合作用（极性较大的辅料倾向与水分子相互作用，因此被排除在蛋白质分子的水合层外，提高蛋白质水合层的稳定性）来提高蛋白质的溶解度，维持蛋白分子的构象稳定性和胶体稳定性，防止其形成不可逆的聚集体。相较于蔗糖，海藻糖二水合物的分子空间大（约2.5倍），其具有更大的体积排斥效应，可以在较低浓度下提供相同的优先水合作用。

对糖类分子而言，随着葡萄糖亚基的数量从1个增加到8个，它们的体积排斥效应将逐渐增强（图3所示）。作为葡萄糖亚基的函数，增加的排除体积有助于消除软相互作用（即范德华、氢键和静电等）的负面影响。

图3 糖类分子体积排斥效应与葡萄糖亚基数量关系

液体蛋白制剂中蔗糖和海藻糖稳定功能的差异在实践中并未得到广泛记录。由于蛋白质溶液中通常使用缓冲盐或张力调节剂，它们的种类、浓度和产生的pH值也可能影响蛋白质稳定性并弱化两种糖之间的稳定效果差异。

冻干制剂

由于蛋白质在冷冻干燥时会损失大量的水分，因此二糖可以直接与蛋白质相互作用（水替代）并将蛋白质固定在玻璃状基质中（玻璃态），抑制因脱水引起的蛋白质分子构象变化。

（1）水替代假说

由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冻干过程中失去水分后，多羟基化合物（如蔗糖和海藻糖等）中的羟基可以替代蛋白质表面水分子的羟基，通过氢键与蛋白质分子结合，在蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，防止蛋白质因冻干而变性，保持蛋白质结构与功能的完整性。

图4 水替代假说示意图

（2）玻璃态假说

物质在玻璃态下兼有固体和流体的行为，具有粘度高，不易形成结晶，且分子扩散系数很低的特点，因此，在冻干过程中，具有粘性的蔗糖和海藻糖可以包围在蛋白质分子周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的链段运动受阻，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。

图5 玻璃态转化示意图

关于蔗糖和海藻糖的玻璃化转变温度T_g，蔗糖为65∼75 °C，海藻糖为110∼120 °C，在不同的干燥或失水过程中（包括冷冻干燥和喷雾干燥），海藻糖可轻易地干燥为非晶体材料。

注：T_g也可以看做是分子链段能运动的最低温度，其数值的高低与分子链的柔性有直接关系：分子链柔性越大，T_g就低；分子链刚性大，T_g就高，稳定性越好。

Part.3生物制剂中蔗糖和海藻糖的选择依据

研究人员在选择蔗糖或海藻糖作为蛋白类生物制剂的保护剂时，需要考虑以下几个因素：

pH耐受及水解稳定性

由于蔗糖中糖苷键的自由能较高（27 kcal/mol），在pH值为≤4时，会产生可诱发美拉德反应的还原糖（葡萄糖和果糖），通常在pH值＞5的制剂中蔗糖不会发生水解，但是若溶液中含有易结晶的盐，会导致制剂的pH值大幅下降。由于海藻糖中的糖苷键具有较低的能量（＜1 kcal/mol），因此海藻糖表现出较高的耐水解性，在pH 3.0的情况下仍然非常稳定。

吸湿性

结晶海藻糖在相对湿度95%以下时无吸湿性，这有助于提升冻干制剂在储存过程中的长期稳定性。虽然蔗糖吸湿性也较低，但仍然高于海藻糖。

粘度和氢键结合能力

在预填充注射器中，较高的溶液粘度可能会增加注射难度。因此，在开发高浓度蛋白质制剂时，控制溶液粘度是优先考虑事项，而蛋白质溶液中添加糖通常会增加溶液的粘度。由于二糖的分子量和结构相似，理论上在相同摩尔浓度下，其水溶液中应具有相似的粘度，但事实上，海藻糖水溶液在相同摩尔浓度下通常表现出比蔗糖更高的粘度，这是由于海藻糖较高的水合体积所致，其差异主要体现在较高浓度和较低温度下粘度的显著增加。

此外，海藻糖相比于其他糖类有更多氢键结合水，形成氢键的能力更强，更容易与水分子结合，使得在低含水量的剂型中选择海藻糖的制剂更不易发生水解。

玻璃化转变温度T_g

与蔗糖相比，海藻糖具有更高的T_g，能够为冻干制品提供更高的升华温度和储存温度（一般情况下能够提供T_g＞50℃）；当蛋白质浓度升高时，相应制品的T_g也会提高，当蛋白质浓度升高到一定程度时，使用蔗糖作为稳定剂的制品可能仍具有较高的T_g，在这种情况下，海藻糖T_g高的优势将会被弱化。

抑制蛋白去折叠

蔗糖在冻干过程中抑制蛋白去折叠方面比海藻糖更有优势，这种优势在蛋白预冻阶段非常不稳定（需要较高的糖浓度）或蛋白浓度较高时更加明显。海藻糖的相对不稳定性是因为其在预冻和干燥过程中更容易与蛋白产生相分离。

性价比

虽然海藻糖在多个方面优于蔗糖，但其价格却远远高于蔗糖，这一定程度上阻碍了其在生物制品商业化生产中的大规模使用。在冻干保护效果十分接近的情况下，研究人员可能会优先选择性价比更高的蔗糖。

综上所述，海藻糖在耐受酸性环境、水解稳定性、低吸湿性、粘度和氢键结合能力和高玻璃化转变温度等多个方面表现出优于蔗糖的特性，但考虑到成本因素，蔗糖仍然是一种经济有效的选择。因此，一款合适的稳定剂，需要对制剂类型（溶液/冻干粉、高浓度/低浓度等）、制剂稳定性和成本等制剂实际需求进行系统性评估和测试后进行选择。

Part.4蔗糖和海藻糖在抗体药物中的应用情况

统计了FDA上市的150个抗体药物制剂处方，其中46.7%的制剂使用蔗糖（注射液：冻干粉=7：3），15.3%的制剂使用海藻糖（注射液：冻干粉=6：4）。溶液剂中蔗糖的添加范围一般为10 -100 mg/mL，海藻糖的添加范围一般为40 -104 mg/mL；冻干粉中蔗糖/抗体（质量比）范围一般为0.5-5，海藻糖/抗体（质量比）范围一般为0.8-2。

此外，糖类还是生物制剂常用的渗透压调节剂，以蔗糖为例，其调节渗透压的原理‌为：当蔗糖溶解在水中时，会形成一个浓度梯度，即水中的溶质浓度高于蔗糖溶液中的溶质浓度，这种浓度梯度会驱动水分子从低浓度区域向高浓度区域移动，从而达到调节渗透压的效果‌。

Part.5蔗糖和海藻糖在生抗体药物中的应用举例

Keytruda-帕博利珠单抗注射液

大名鼎鼎的“K药”，是一种PD-1抑制剂，于2014年上市。作为默沙东的拳头产品，2023年以250亿美元的销售额登顶“药王”，给药途径为静脉注射，其制剂处方为：每1 mL溶液含L-组氨酸（1.55 mg）、聚山梨酯80（0.2 mg）、蔗糖（70 mg）。

Dupixent-度普利尤单抗注射液

由赛诺菲和再生元合作开发，于2017年推出的靶向白细胞介素4（IL-4R）产品，2023年销售额为118.5亿美元，位居全球生物药第三，给药途径为皮下注射，其制剂处方为：

300 mg/2 mL溶液：L-精氨酸盐酸盐（10.5 mg）、L-组氨酸（6.2 mg）、聚山梨酯80（4 mg）、醋酸钠（2 mg）、蔗糖（100 mg）；

200 mg/1.14 mL溶液：L-精氨酸盐酸盐（12 mg）、L-组氨酸（3.5 mg）、聚山梨酯80（2.3 mg）、醋酸钠（1.2 mg）、蔗糖（57 mg）。

Cosentyx-司库奇尤单抗注射液

诺华于2015年推出的靶向白细胞介素17（IL-17）产品，2023年销售额为49.8亿美元，可供皮下或静脉注射，其制剂处方为：

150 mg/mL（皮下注射）：L-组氨酸/组氨酸盐酸盐一水合物（3.103 mg）、L-蛋氨酸（0.746 mg）、聚山梨酯80（0.2 mg）、海藻糖二水合物（75.67 mg）；

125 mg（静脉注射）：L-组氨酸（5.67 mg）、L-组氨酸盐酸盐一水合物（13.3 mg）、L-蛋氨酸（3.73 mg）、聚山梨酯80（1 mg）、海藻糖二水合物（426 mg）。

Avastin-贝伐珠单抗注射液

罗氏于2004年推出的靶向血管内皮生长因子（VEGF）产品，2023年销售额为21.2亿美元，给药途径为静脉注射，其制剂处方为：每1 mL溶液含α、α-海藻糖二水合物（60 mg）、聚山梨酯20（0.4 mg）、无水磷酸氢二钠（1.2 mg）、磷酸二氢钠一水合物（5.8 mg）。

Part.6细菌内毒素对生物制剂研发和生产的挑战

内毒素（或称脂多糖）来源于细菌死亡后的包涵体释放物，属于热原的一种。注射含有热原的药物会导致热原反应，轻则使患者出现发冷、高热，重则昏迷休克甚至危及生命。一般注入人体的注射液中细菌内毒素含量达1 μg/kg时即可引发热原反应。在抗体药物生产过程中，生产用设备及原材料（如辅料、培养基、添加剂、血清等）均可能受内毒素污染，因此在生产过程中需要执行严格的无菌操作及建立相关的质量控制策略，确保药品符合药典及临床使用的安全性相关要求。

葛店人福药辅提供性价比高、安全可靠、规格多样化的低内毒素及超低内毒素糖类产品，特别是蔗糖（甘蔗和甜菜来源）和海藻糖，公司采用超滤、纳滤、离子交换等先进技术，有效降低产品的内毒素与生物负载、重金属及无机盐等杂质，助力制剂企业降本增效，为客户的药品安全保驾护航。

表1 葛店人福药辅蔗糖和海藻糖产品情况

参考资料：

（1）FDA橙皮书数据库；

（2）Thermodynamic modeling and experimental data reveal that sugars stabilize proteins according to an excluded volume mechanism. J. Am. Chem. Soc (2023), 10.1021；

（3）How Sugars Protect Dry Protein Structure. Biochemistry 2023, 62, 5, 1044-1052；

（4）Properties of Aqueous Trehalose Mixtures: Glass Transition and Hydrogen Bonding, Journal of Chemical Theory and Computation. 2020, 16, 2, 1249–1262；

（5）公众号：莱奥德创冻干工厂-如何合理设计稳定的冻干蛋白配方；

（6）公众号：抗体君-抗体药生产内毒素的控制。

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