薄膜冷冻干燥技术用于流感LNP-mRNA疫苗的冻干保存

表1. 用于 TFFD 的 mRNA-LNP 制剂的处方

配方 P24 含有本文测试的最高浓度的赋形剂（∼27 %，w/v，（蔗糖：15 %;海藻糖：10 %;亮氨酸：0.5 %;P188：1.5 %））。P24 薄膜冻干粉中 mRNA 的包封率与原始 HA mRNA-LNP 的包封效率（即 95.0 ± 0.2%）没有差异，但通过动态光散射测量，从 P24的 HA mRNA-LNP 的流体动力学粒径增加到 108.7 ± 2.2 nm，多分散指数为 0.13（图 2A）。根据冷冻电镜图像，在 P24 粉末重构的样品中未检测到颗粒聚集或融合（图 2B），在经过 TFFD 过程后，mRNA-LNP 的大小和结构也没有显示任何明显的变化。观察到的重构 HA mRNA-LNP 的流体动力学粒径增加的原因仍然未知，但不太可能是由于颗粒聚集造成的，因为图 2A 中的粒径分布曲线没有显示额外的一组较大的颗粒，而图 2 中的冷冻电镜图像B 也可以证明这一点。

图2. TFFD干粉中复溶后的 HA mRNA-LNP 的物理化学表征

事实上，本文也对最近发表的报道 mRNA-LNP 冷冻干燥的论文的数据进行比对，表明大多数研究中的 mRNA-LNP 在使用了优化的赋形剂和冷冻干燥条件进行冷冻干燥后，粒径都会有不同程度的增加，而mRNA的包封率也会降低。更有甚者，在冻干后，粒径增加了62%，mRNA 的包封率降低了 44%（见表2）。

表2. mRNA-LNP 在冷冻干燥前后的流体动力学粒径和 mRNA 包封率

冷冻干燥前的配方 P25 含有 ∼3 % 的赋形剂。由 P25 粉末复溶的 HA mRNA-LNP 中 mRNA 的包封率为 86.9 ± 5.2%，约为原始值的 90%；其流体动力学粒径和多分散系数分别为 134.7 ± 15.1 nm 和 0.22（图 2C）。同样，冷冻电镜图像没有显示颗粒大小和结构或颗粒聚集或融合的任何变化（图 2D）。总体而言，27% （w/v） 的赋形剂在受到 TFFD 后比低浓度的赋形剂更有效地保护 HA mRNA-LNP。最后，本文通过毛细管电泳评估 mRNA 的完整性。从 P24 和 P25 粉末中回收的 mRNA 样品中完整 HA mRNA 占总 RNA 面积的百分比分别为 65.6 %（RNA 浓度，71 ng/mL）和 68.6 %（RNA 浓度，124 ng/mL），不低于原始 mRNA-LNP（即 62.7 %，RNA 浓度，129 ng/mL）和 IVT 样品中的 63.5%（RNA 浓度、 119 ng/mL）（图 2F），表明将 HA mRNA-LNP 置于 TFFD 下不会损害 mRNA 的完整性。

本研究利用SAXS进一步分析 TFFD 对 HA mRNA-LNP 结构和分子结构的影响（图 3）。由 P24 粉末重构的 HA mRNA-LNP 在结构上与原始 HA mRNA-LNP 接近，但由 P25 粉末重构的 HA mRNA-LNP 在结构上与原始不同，这也论证了在薄膜冷冻干燥 mRNA-LNP 时加入足够量赋形剂的重要性。

图3. (A) SAXS散射谱和 (B)电子密度重建

本文使用粉末 X 射线差 （PXRD） 和调制差示扫描量热法 （mDSC） 检查 P24 和 P25 HA mRNA-LNP 干粉的物理性质。PXRD 和 mDSC 数据显示，干粉中 mRNA-LNP 与其他赋形剂的比例影响粉末的物理性质。如图 4C 中的 SEM 图像所示，P24 和 P25 干粉的微观结构揭示了纳米结构聚集体的存在，尤其是在 P25 粉末中，P25 粉末表现出高度多孔的基质，这可能是由于其赋形剂含量较低（P25 中为 ∼3%，而 P24 中为 27%）。

图4. HA mRNA-LNP P24 和 P25 粉末的表征 （A） 粉末 X 射线衍射图，（B） mDSC 热谱图，以及 （C） 粉末的代表性 SEM 图像。

图5. HA mRNA-LNP 在小鼠中单次 IM 注射后、TFFD 之前（原始）和之后（P24 和 P25）的免疫原性

综上所述，本文证明了由 P24 TFFD冻干粉的 HA mRNA-LNP 疫苗与原始液体 HA mRNA-LNP 疫苗相似。更重要的是，接种了从 TFFD 干粉的 HA mRNA-LNP 的小鼠中引发的 HA 特异性抗体反应与接种原始 HA mRNA-LNP 的小鼠的水平相当。因此，TFFD 技术是一种制备 mRNA-LNP 干粉的可行方法，提供了可能将 mRNA 疫苗作为干粉储存和运输的选择。使用 TFFD 技术制备的 mRNA 疫苗粉末的潜在好处还包括替代给药途径，例如使用干粉吸入器通过口服吸入进行肺部给药或使用干粉喷雾器进行鼻内给药。

1. 本文使用TFFD对mRNA-LNP进行冻干，更完整地维持制剂原本的形态；

     
2. 本文筛选得到了针对特定mRNA-LNP的最佳冻干赋形剂；
     
3. TFFD冻干粉免疫小鼠后，可达到和原液相当的体液免疫应答。

    

1. J.R. Melamed, S.S. Yerneni, M.L. Arral, S.T. LoPresti, N. Chaudhary, A. Sehrawat, H. Muramatsu, M.G. Alameh, N. Pardi, D. Weissman, G.K. Gittes, K.A. Whitehead, Ionizable lipid nanoparticles deliver mRNA to pancreatic beta cells via macrophage-mediated gene transfer, Sci. Adv. 9 (2023) eade1444.
2. D. Pogocki, C. Schoneich, Chemical stability of nucleic acid-derived drugs, J. Pharm. Sci. 89 (2000) 443–456.
3. M. Packer, D. Gyawali, R. Yerabolu, J. Schariter, P. White, A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems, Nat. Commun. 12 (2021) 6777.
4. L. Schoenmaker, D. Witzigmann, J.A. Kulkarni, R. Verbeke, G. Kersten, W. Jiskoot, D.J.A. Crommelin, mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: structure and stability, Int. J. Pharm. 601 (2021) 120586.
5. K. AboulFotouh, Z. Cui, R.O. Williams 3rd, Next-generation COVID-19 vaccines should take efficiency of distribution into consideration, AAPS PharmSciTech 22 (2021) 126.