可增强mRNA递送的酸降解脂质纳米颗粒
载mRNA脂质纳米颗粒（LNP）在应用于医药领域方面具有良好前景，但目前仍有在内体（Endosome）中低破坏率、高毒性以及在组织中的长时间滞留等问题限制其应用。可快速在内体中水解的LNP（RD-LNP）有望解决LNP所面临的限制，并拓宽其应用范围。该研究制备了一种由聚乙二醇脂质、阴离子脂质和阳离子脂质组成的新型“叠氮-缩醛”酸降解连接物，能在几分钟内于内体中水解，但在pH=7.4的条件下能稳定存在长达21天，显著提升了LNP-mRNA复合物在体内和体外的性能。
图1 . RD-LNPs增强mRNA在体内多器官的递送
PEG脂质能够延长LNP的循环时间，并增强其在组织中的扩散能力，降低LNP的内体降解率，并诱导抗PEG抗体的产生。目前，临床产品中使用的LNP含有0.5-1.5 mol%的PEG脂质，这些LNPs具有适合当前临床应用的最佳尺寸，主要用于肝脏输送和疫苗开发。但对于吸入或颅内注射输送，含有更高PEG含量的LNPs可能更有益。
本研究进一步探讨了含有高水平PEG脂质的LNPs以及不可降解的PEG2k-胆固醇偶联物（称为NDP-LNPs）与转染HEK 293T细胞效率间的关系(图2a)。结果显示，含有10和20 mol% PEG脂质的ADP-LNPs能有效转染HEK 293T细胞，甚至在40 mol% PEG脂质中也有中等效率(图2b)。相比之下，含有20 mol% PEG脂质的NDP-LNPs转染细胞无效。PEG脂质的快速水解能显著提高mRNA的递送效率，且ADP-LNPs比NDP-LNPs更有效地逃离核内体(图2c)。此外，ADP-LNPs在-80℃或4℃保存60天后仍保持良好的转染效率。以上结果表明，ADP-LNPs在mRNA的高效递送中扮演着关键角色，且具备产品开发所需的良好稳定性。
于迫切需要新的高效低毒的造血干细胞（HSPCs）转染试剂，本研究还探讨了含有绿色荧光蛋白（GFP） mRNA的ADP-LNPs，标准LNPs（Std-LNPs）和电穿孔（EP）转染HSPC的效率。结果显示，在10 μg/ml mRNA的剂量下，ADP-LNPs能转染90%的HSPCs，同时保持60%的细胞活力。相比之下Std-LNPs只能转染约50%的HSPCs。使用增强的绿色荧光蛋白（EGFP） mRNA电穿孔的HSPCs转染率为82%，但细胞存活率仅为35%(图2d)。ADP-LNPs较低的毒性是由于高水平的聚乙二醇化保护它们免受HSPC细胞膜的正电荷影响。此外，我们还比较了ADP-LNPs与EP的转染效果。并进一步研究了ADP-LNPs是否可以将Cas9 mRNA和gRNA递送到HSPCs并进行基因编辑。结果显示，ADP-LNPs在HSPCs中产生了30%的插入缺失(图2e)，表明它们有潜力作为HSPC的转染试剂并发挥治疗作用。
接下来研究了ADP-LNPs在小鼠体内递送mRNA的能力，并与含有二肉豆蔻酸甘油酯-PEG（sd-LNPs）或NDP-LNPs进行了比较。药代动力学研究结果显示，ADP-LNPs的循环半衰期为47分钟，比Std-LNPs（t½= 6分钟）和常用的Onpattro（t½= 15分钟）都要长(图2f)。以Ai9小鼠为模型，ADP-LNPs转染了约90%的肝脏细胞(图2g,h)，并特异性靶向了主要的肝细胞类型，如肝细胞、巨噬细胞和内皮细胞；此外，ADP-LNPs还转染了脾脏中25%的细胞，并特异性靶向了巨噬细胞，这些细胞是许多免疫疗法的靶细胞。
图2. ADP(1)提高了LNPs在体内和体外的转染效率
含有阴离子脂质的 LNP能够靶向脾脏并通过增加其负电荷密度来减轻LNP毒性，但具有负电荷密度的LNP转染效率较低，因为需要正表面电荷密度来触发有效的细胞摄取和内体破坏。该研究合成了阴离子脂质2，含有三种通过叠氮缩醛连接到胆固醇的羧酸，制成的兼具负表面电荷及引发内体破坏功能的LNP命名为ADA LNPs。阴离子脂质2在内体中的水解会使内体的渗透压增加并诱导内体的渗透失稳，此外ADA-LNPs在核内体中的电荷密度也会变得更正，这应该有助于它们与核内体膜中的阴离子脂质融合（图3a）。与不可降解的阴离子脂质制成的LNP，（NDA1-LNPs）对比，ADA-LNPs转染HEK 293T细胞的效果明显优于NDA1-LNPs（图3b）。此外，ADA-LNPs比NDA1-LNPs的转染效果更好，在细胞中产生的荧光素酶表达水平比NDA1-LNPs高约45-145倍。此外，用ADA-LNPs处理的细胞含有与NDA1-LNPs相比，IL-22 mRNA产生的IL-22蛋白是NDA1-LNPs的8-13倍（图3d）。
以含有量子点-DNA偶联物的ADA-LNPs确定阴离子脂质2的快速水解是否会增强ADA-LNPs内体破坏及逃离核内体效果。图3e表明，ADA-LNPs快速诱导量子点-DNA偶联物的内体释放，并导致约60%的内吞量子点从内体释放，而NDA1-LNPs和Std-LNPs大部分停留在核内体中，只有20%的内吞量子点从核内体中释放出来。ADA-LNPs能够有效地渗透并破坏核内体，也可以有效地诱导细胞凋亡，并提高阴离子LNPs的mRNA递送效率。以Ai9小鼠为模型，通过荧光素酶mRNA和Cre mRNA研究了ADA-LNPs在体内递送mRNA的能力。图3f显示，ADA-LNPs在脾脏中产生的荧光素酶活性比NDA1-LNPs或NDA2-LNPs高约8倍，转染了32%的脾脏细胞和45%的肝脏细胞（图3g），肝细胞是肝脏中转染的主要细胞类型，除此之外主要转染的是脾脏巨噬细胞（图3h，i），还有约5%的脾脏B细胞。以上实验证明了ADA-LNPs作为治疗各种免疫疾病的药物的潜力，并证明叠氮-缩醛连接物可以作为开发用于mRNA递送的新ADLs的平台。
图3. ADA（2）在体外和体内有效地
破坏内体并提高LNPs的转染效率
总结
该研究创新性提出了一类可在核内体中快速水解的，由叠氮-缩醛连接体合成的LNPs（RD-LNPs）。本研究结果表明，RD-LNPs增强了mRNA在多种细胞类型和器官中的递送，在多个器官中的表现优于传统LNPs，在医学应用具有巨大的潜力。
