PROTAC是一种异双功能小分子，由E3连接酶的配体、靶蛋白结合配体和连接两者的连接体组成，促进靶蛋白和连接酶的相互作用，导致靶蛋白的泛素化及降解。虽然存在一些E3连接酶的小分子配体，但大多数降解化合物都是基于VHL和CRBN的配体，这些配体是Cullin-RING连接酶家族(CRLs)中特定E3连接酶的底物识别亚基。迄今为止，大约600个人类E3连接酶中只有少数被应用于TPD。增加TPD中使用的E3的数量将需要识别额外的E3连接的配体。探索除VHL和CRBN外的E3连接酶及其配体可以为TPD应用提供更多的化学选择。
利用计算机辅助药物设计(CADD)，著名的靶向蛋白降解药物研发公司Arvinas研究团队从KLHDC2KD与其同源C端底物SelK结合的可用晶体结构开始，SelK由其C端甘氨酸残基锚定(PDB：6DO3)。SelK肽的末端甘氨酸(Gly91)被保留，因为它与底物口袋结合最深，并与Ser269、Arg241和Arg236形成四个氢键(H键，黄色虚线)，而Gly90则被吡啶酮环取代(图1a，步骤1)。吡啶酮环从顶面和底面与Arg236和Lys147形成π-阳离子键，并模仿Gly90的羰基与Trp191形成氢键(图1a，步骤1)。添加了一个萘环后，该环与Lys147形成氢键，以加强π-阳离子与吡啶酮环的相互作用(图1A，步骤2)。
大基团的萘甲酮环在两个环系之间实施了非平面构象，分别将KDRLKZ-1和KDRLKZ-2的仲丁基或异丁基引导到由Tyr50、Leu342、Leu343、Trp321和Trp370组成的疏水口袋中(图1a，步骤3)，同时将连接物氨基甲酸酯放置在Arg236附近形成临时氢键，并将连接子从口袋中引导到泛素的区域(图1a，步骤4)。作者依靠从头设计和化合物合成的循环来进一步优化这些新的小分子，并使用表面等离子体共振(SPR)的直接结合实验的连续迭代循环来生成数据，为配体优化提供信息。通过AlphaLISA置换试验测定化合物取代SelK多肽的能力。这最终导致了一系列小分子配体的发现，这些小分子配体有效地与KLHDC2KD结合(图1a-i)。
KDRLKZ-1在KLHDC2KD底物结合口袋中的结合位置通过共晶结构得到证实(图1g-i)。如图所示，KDRLKZ-1填充KLHDC2底物结合袋，并进行类似于天然底物的相互作用，其C端与SelK的C端几乎重合(图1h)。正如作者最初对KDRLKZ-1的从头CADD模型预测的那样，羧酸与KLHDC2形成4个氢键或盐桥作用;吡啶酮与Trp191形成氢键，并与Arg236和Lys147分别从上、下两个面发生π-阳离子相互作用;萘啶酮环在空间上强制形成非平面构象，引导羰基与Lys147形成氢键，并将正丁基置于疏水口袋中;连接链氨基甲酸酯位于Arg236附近并指向口袋外(图1i)。
为了进一步表征KLHDC2配体，作者纯化了全长KLHDC2 E3连接酶及其同源接头蛋白EloB和EloC(该复合物以下简称KBC)，并使用天然底物(用菁5荧光团标记的USP1肽)进行了泛素化实验。作者确定了USP1泛素化依赖于KLHDC2，并发现过量的底物以及小分子配体KDRLKZ-1可以与USP1竞争KLHDC2的泛素化。这些实验证明纯化的KBC具有活性，并且可以与KLHDC2靶向的小分子结合。
图1
KLHDC2配体结合能力研究
为了测试新的KLHDC2配体在被合成为双功能分子时与KLHDC2结合的能力，作者通过与琼脂糖珠上固定配体的相互作用促进KLHDC2的下拉，使用HiBiT信号进行量化。开发了类似的测定VHL与其配体相互作用的方法。对于VHL和KLHDC2，携带靶向各自连接酶的特定探针的微球的HiBiT信号明显高于单独与生物素偶联的微球(图2a)。此外，生物素标记的KLHDC2-配体探针可以与细胞提取物中的内源性KLHDC2结合(图2B)，这种相互作用可以被多余的配体竞争性地抑制。
图2
在设计了可以诱导BRD4BD2和KLHDC2KD形成三元复合物的PROTACs之后，作者接下来测试了这些PROTACs是否可以驱动细胞中BRD4的有效降解。BRD4水平由添加到内源性BRD4中的氨基末端HiBiT标签表征。KLHDC2-BRD4 PROTAC分子由两种连接类型和三种KLHDC2配体生成 (图3a)，并将羧基改为甲酯基团作为前药，甲酯在进入细胞后会被细胞酯酶加工后转化为羧酸，并且酯基团比羧酸基团有更好的细胞渗透性。酰胺基PROTAC分子被设计为E3-dead阴性对照。
含有甲酯KLHDC2配体的KLHDC2-BRD4 PROTAC分子能够快速有效地降解HiBiT-BRD4，在4-6小时内降低93%(图3b,c)。带有酸基团的PROTAC也能降解HiBiT-BRD4，但不如含酯分子(6小时降解动力学如图3d所示)。根据SPR数据(图2)，非PEG连接子对BRD4的降解效率更高。正如预期的那样，具有酰胺基团的PROTAC分子在HiBiT-BRD4检测中几乎没有活性(图3d)。
为了证实观察到的BRD4降解依赖于UPS，作者观察了使用蛋白酶体抑制剂MG-132和类泛素化抑制剂MLN4924后HiBiT-BRD4水平。结果表明，这两种UPS抑制剂都可以抑制在K2-B4-5e存在时观察到的荧光减少(图3e)。
为了测试KLHDC2 - BRD4 PROTAC分子的活性是否依赖于KLHDC2，作者使用干扰RNA (siRNA)敲除KLHDC2，发现这完全阻断了K2-B4-5e诱导的HiBiT-BRD4降解(图3f)。作为对照，敲除不相关E3连接酶DCAF16对KLHDC2介导的BRD4降解没有影响(图3f)。在该研究中，作者发现KLHDC2-BRD4 PROTAC分子对细胞系中BRD2和BRD3也有降解效果(图3g)，这个结果与其他使用JQ1作为靶蛋白配体、基于CRBN或VHL的PROTAC表现一致。与BRD4的情况一样，K2-B4-5e对BRD2的降解在敲除KLHDC2后完全阻断(图3g)，但敲除DCAF16没有影响。
在纯化全长KBC E3连接酶(KLHDC2与EloB和EloC的复合体)的过程中，作者观察到KBC从尺寸排除色谱柱中洗脱出来的尺寸大于其预期的分子量。KBC络合物的分析尺寸排除层析显示了一个主要峰，其洗脱曲线与分子量约为200kDa的络合物一致(图4a，灰色痕迹，图4b，顶部凝胶)。尽管在一些底物连接蛋白的重组制剂中发现了底物的共纯化，但SDS-PAGE和LC-MS分析表明KBC复合体没有受到污染的迹象。基质辅助激光解吸电离(MALDI)分析表明，样品中存在一到四个KBC络合物的混合物。值得注意的是，KBC与其底物SelK肽孵育后，洗脱图谱发生了变化。在分析尺寸排除色谱实验中观察到的这种变化是浓度依赖的，SelK导致KBC的洗脱向右移动。KBC-SELK肽复合体的右移洗脱图谱与预期的分子量匹配，与一个KBC复合体一致(图4a，蓝色痕迹，图4b，底部凝胶)。在MALDI实验中，作者也观察到KBC-SelK肽复合体的质量图谱发生了变化。
对于以上现象，作者提出了一个假设，即KBC复合体是一种动态的低聚物，受到底物结合到其KLHDC2KD口袋中的影响。由于KLHDC2是一种E3连接酶，它识别C-末端的GlyGly-End肽作为底物，作者想知道它自己的C-末端(终止于GlySer)是否参与了这种动态复合体的形成。在AlphaLISA置换试验中，来自KLHDC2 C-末端的短肽可以取代底物SELK(图4c)，尽管亲和力较低(图4d)。与它们较弱的结合亲和力一致，将这些肽与KBC孵育会导致KBC寡聚体的部分解离(图4e)。接下来，作者试图了解KLHDC2KD与其反式C-端肽形成的复合体的结构。KLHDC2 C端肽与KLHDC2KD络合物的共晶结构表明，其结合模式与其天然底物SelK的结合模式相同(图4f)。如图所示，Trp270为了适应Ser406的额外原子而略有移动，但与Arg236的关键相互作用被保留了下来。
图4
Cryo-EM显示KLHDC2-EloB-EloC复合物是一个四聚体
为了更详细地定义低聚KBC物种的性质，作者对化学交联的KBC复合物进行了单粒子冷冻电镜（single-particle cryo-EM）分析。KBC复合物的单粒子分析和cryoSPARC的初始模型生成显示了异质性KBC复合物，但大多数颗粒是KBC四聚体。四聚体复合物的三维(3D)变异分析在cryoSPARC中产生了四个密度不同的EloBC亚基类别。对密度最完整的一小部分粒子的进一步细化表明，KBC 分子的对称排列是二聚体的二聚。
因此，作者将C2对称性应用于非均匀细化（non-uniform refinement），以获得最终分辨率为3.8Å的全长KBC复合体的3D重建(图5a)。对称复合体的一半由两个KBC亚复合体组成；作者将一个原型染成紫色并将其命名为KLHDC21，将另一个染成橙色并将其命名为KLHDC22。在每个亚复合体中，KLHDC2是饱和的，而相应的EloB和EloC结合配对以较浅的颜色着色(图5a)。
KLHDC2、EloB和EloC的kelch结构域在图中被明确地建模，并且在连续kelch结构域的界面处存在额外的密度，在那里它们与EloB和EloC相互作用。非对称KBC单元的叠加表明，KLHDC2与EloB和EloC的BC-box结合是由KLHDC2的Leu364、Ser366和Val372介导的。虽然BC boxes重叠，但KLHDC2的C-末端的其余部分没有重叠。C-末端的剩余部分对应于KLHDC2预测的Cullin box。如图7b所示，在四聚体中，只有紫色的KLHDC21 Cullin盒被正确定位以与CUL2相互作用，而KLHDC22 Cullin盒则没有。
通过分析尺寸排除色谱，我们发现CUL2可以与KBC形成配合物(扩展数据图7c)。
我们的模型进一步表明，连续KLHDC2分子之间的相互作用是由KLHDC21的N和C末端介导的。首先，KLHDC21的残基400-406与KLHDC22的底物结合位点结合介导了一组相互作用(图5b)。这些相互作用与上述晶体结构中观察到的与C端肽的相互作用非常相似。其次，BC boxes和Cullin boxes中KLHDC21的C端残基也与KLHDC22相互作用(图5b，插图)。KLHDC21的Lys376在KLHDC22的主链上与Asn184形成氢键;KLHDC21的Glu377与KLHDC22的His345形成氢键;KLHDC21的Phe375与KLHDC22的Leu58形成疏水相互作用。
图5
总结
https://www.nature.com/articles/s41594-023-01146-w#Abs1
