JACS | 基于USP7的DUBTACs—靶蛋白去泛素化
文摘
2024-04-19 03:13
荷兰
论文题目：USP7-Based Deubiquitinase-Targeting Chimeras Stabilize AMPK通讯作者：美国Tisch Cancer Institute的Jian(名) Jin(姓)教授和哈佛医学院病理系的魏文毅教授蛋白靶向降解技术包括分子胶、PROTACs，LYTACs，PROTABs、KineTACs等技术，最终的结果是过度表达的蛋白质被降解。然而在某些疾病中，部分蛋白质的表达量下降或因突变丧失功能，如肿瘤抑制蛋白类。稳定这些蛋白有望治疗疾病。DUBTACs(deubiquitinase-targeting
chimeras，靶向去泛素化酶的嵌合体)可利用细胞内去泛素化酶将目标蛋白去泛素化从而避免降解，进而使蛋白水平增加。该技术在2022年首次发表在Nat. Chem. Biol.上，其利用去泛素化酶OTUB1的共价配体EN523设计合成了可稳定CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)的DUBTACs。本文作者同样基于OTUB1于2022年在J. Am. Chem. Soc.发表了系列连接DNA寡核苷酸的DUBTACs，可稳定肿瘤抑制转录因子FOXO、p53和IRF等。但这些研究，都利用OTUB1，且配体是共价的，因此可能面临选择性差、毒性强等劣势。开发基于其他去泛素化酶的工具分子很重要。作者利用先前报道的可在细胞内结合USP7的配体USP7i-#4a设计DUBTACs。分析USP7与配体的共晶结构，发现伯氨基位于结合口袋外。作者基于此设计合成出了1-13。其中，仅7(MS6869)和13可稳定ΔF508-CFTR突变蛋白随后对MS6869进行机制分析，其可提高蛋白水平，不提高mRNA水平.MS6869介导形成了新的相互作用(GST的pulldown实验拉下来了flag标签蛋白)且其减少了CFTR的泛素化水平，可时间依赖及浓度依赖性地稳定CFTR。浓度增加的CFTR蛋白大部分位于膜上，表明其发挥功能性作用。加入USP7及CFTR配体进行竞争实验发现MS6869稳定蛋白地功能被影响(Lumacaftor为CFTR配体)。敲除USP7同样使其丧失稳定蛋白的功能。表明MS6869稳定蛋白质需要依赖USP7。作者使用TMT标记的质谱实验发现MS6869可特异地稳定CFTR。(TMT: tandem mass tag 串联质谱标签)以上结果表明USP7可用于去泛素化酶设计合成DUBTACs。为了进一步验证USP7的适用性，作者又合成了系列基于USP7的靶向AMPK的DUBTACs 14-25。USP7的配体依旧是ligand #1；AMPK的配体为激动剂991，其可结合AMPK的ADaM位点，该位点位于激酶结构域的α亚单位和糖结合模块β亚单位的交界处。991可选择性激动AMPKβ1亚单位而不影响AMPKβ2亚单位。使用合成的DUBTACs处理后，检测AMPK的α亚单位和β亚单位的水平，发现22、23和24(MS8118)可稳定AMPKβ1，而不影响AMPKβ2和AMPKα。并且AMPK的下游底物，ACC(acetyl-coA carboxylas，乙酰辅酶A羧化酶)增加。MS8118的引入使USP7和AMPKβ1之间产生新的相互作用，且使AMPKβ1泛素化水平下降。竞争实验可干扰MS8118的稳定蛋白能力。敲除USP7后也会影响，表明MS8118发挥作用需要依赖USP7。DUBTACs稳定的AMPKβ1是否会影响细胞功能？作者进行了Oil Red O染色实验以评价AMPK在脂肪代谢中产生的影响。22、23和MS8118可减少HeLa细胞中脂肪堆积。可抑制细胞克隆的形成，进而影响HeLa细胞生长。作者随后使用USP7的另一个非共价抑制剂GNE6776，合成了26-36。相较上个实验，本实验的DUBTACs对AMPKβ1也有微弱作用。但55(MS8655)、56(MS8656)和57(MS8657)可显著稳定AMPKβ2。这三个化合物可呈浓度依赖性趋势稳定AMPKβ2，对AMPKβ1仅产生微弱影响，同时p-ACC水平发生变化。作者将MS8657进行功能研究。其引入了USP7和AMPKβ2新的相互作用，且可减少泛素化水平。竞争性实验和敲除实验均证明USP7在其中发挥作用。进一步研究三个化合物对AMPKβ2功能影响，发现其同样可干扰Hela细胞的脂质代谢，同时抑制克隆形成的个数和尺寸。- PROTAC中通过优化linker和E3连接酶配体来产生好的疗效，在DUBTAC中同样可以这样做。
- 本文中更改了USP7的配体导致DUBTAC对AMPK亚单位的选择性改变，此机制值得深究，如解晶体结构。
- 具体是怎么去泛素化的需要进一步研究，这个过程是否有其他蛋白的参与呢？
![]()
