2024年3月13日，来自英国帝国理工学院的Edward W. Tate教授和英葛兰素史克（GSK）的科学家Rishi R. Shah在JMC上发表了题为“Structure-Guided Design and Optimization of Covalent VHL Targeted
Sulfonyl Fluoride PROTACs”的文章，研究首次揭示了共价VHL配体可以直接实现双功能降解设计，扩大了共价E3连接酶PROTACs的底物范围。![]()
Von Hippel-Lindau (VHL)蛋白是PROTAC领域最广泛招募的E3连接酶之一。迄今为止报道的所有有效的小分子VHL结合物都具有(R)-羟脯氨酸基序，它与VHL的HIF1α结合位点的Ser110形成必要的相互作用，但限制了跨细胞膜的被动运输。该基序被认为是VHL识别所必需的，是VHL PROTAC效价和细胞摄取的优化的一大挑战。以共价方式与E3连接酶配位的PROTACs通过将三元复合物转化为修饰的E3与底物之间的简单二元相互作用（图1A），从而比可逆配位的PROTACs具有潜在优势。最近报道的含有磺酰氟的共价CRBN E3连接酶结合剂显示出有趣的分子胶活性，尽管它们尚未被纳入共价PROTAC。文章报道了第一个合理设计的共价VHL配体的设计和优化。证明了已知VHL结合剂的羟基脯氨酸基序可以被磺酰氟部分取代，并且通过结构导向优化生成了一个配体，它能共价修饰HIF1α结合位点中VHL的Ser110。作者认为，这种新型共价VHL PROTAC模式将为未来研究VHL招募PROTAC的靶标结合和优化药代动力学和药效学特性提供价值。VH032是迄今为止在PROTACs中应用最广泛的VHL配体，其结合模式是通过(R)-羟脯氨酸基序与Ser110形成一个关键的氢键(图1B)。在最初的配体设计中，作者试图用磺酰氟取代羟基，这是一种亲电warhead，具有平衡的反应性，在生理条件下抗水解，以及具有在半胱氨酸(包括丝氨酸)以外的各种亲核残基上共价修饰蛋白质的能力。通过对接VH032/VHL复合物（图1D）中的原型共价配体VHL-SF1（图1C），研究了羟基置换如何干扰VHL的结合。这些模型表明，VHL-SF1具有共价结合Ser110的潜力，从而维持在羟脯氨酸基序中观察到的一些关键相互作用，尽管分子的其余部分有一定程度的位移，这可能会损害VH032所表现出的非共价相互作用。作者认为VHL-SF1是探索共价VHL修饰的合理起点。![]()
图1.共价PROTACs；VH032/VHL共晶结构；VHL-SF1的生成以及对接
为了评估VHL - SF1共价修饰VHL的能力，作者首先开发了一种链霉亲和素转移试验，将重组人VCB (VHL蛋白与长链蛋白C和长链蛋白B的稳定复合物)暴露于VHL- SF1 - Biotin。当样品与链霉亲和素混合并通过抗VHL Western blot分析时，可观察到分子量的明显变化，从而直接量化 VHL 的生物素化。该实验显示，10 μM VHL- SF1
- Biotin在室温孵育2小时后修饰了32%的VHL，进一步证实了探针的浓度依赖性(图2)。![]()
图2. VHL - SF1和VHL-SF2共价修饰VHL
与这种适度的反应性相一致，在竞争荧光极化(FP)实验中，浓度高达100 μM的VHL-SF1无法取代已知占据VH032结合位点和第二个VHL结构域的荧光团标记的HIF1α肽(图2C)。接下来，作者专注于开发第二代共价VHL结合剂，增强效力和占有率。从先前报道的VHL结合物的结构-活性研究中获得灵感，研究了VHL-SF1类似物的对接状态，包括VHL-SF2，其中的叔亮氨酸分子换成了甲基异噁唑，连接载体移到了苄基位置（图3A）。与VHL-SF1不同的是，这一分析表明VHL-SF2可与Ser110共价结合，同时保持与VH032的许多非共价相互作用（图3B)。![]()
图3. VHL-SF2的结构及分子对接；探索VHL-SF2的作用
首先，对VHL - SF2 - biotin进行链亲和素移位实验，并观察到在相同条件下VHL - SF1 - biotin的VHL修饰程度更大(图2)。此外，在FP实验中，VHL - SF2能够取代标记的肽，在2小时的表观IC50为35 μM，与预测的VHL HIF1α结合位点的共价占有率一致(图3C)。受此VHL生物化学作用证据的鼓舞，作者通过HEK293T细胞的竞争拉下实验探索了VHL - SF2在活细胞中的作用(图3E)。SDS-PAGE和Western blot分析证实了VHL- SF2 - Biotin对VHL的拉下作用，与预期的共价作用一致，可以通过VHL-SF2预处理进行剂量依赖性竞争。通过NanoBRET靶结合实验进一步证实了靶结合和细胞VHL结合的效力，评估了VHLNanoLuc与HEK293细胞中细胞渗透性荧光VHL示踪配体之间相互作用的抑制作用(图3D)。与FP实验结果一致，VHL-SF2抑制BRET信号的IC50值为35 μM，而VHL-SF1和VH032的IC50值分别为>100 μM和0.5 μM，与细胞内HIF1α结合位点占有率一致。在离体蛋白和完整细胞中验证了VHL-SF2对VHL的参与之后，作者合成了一种BRD4靶向PROTAC—BRD-SF2，结合了VHL- SF2和已知的BRD4配体(图4A)，并使用BRD4 HiBiT检测评估了目标蛋白的降解情况。实验结果显示，未经优化的PROTAC诱导BRD4降解(DC50:
17.2 μM, Dmax: 60%，孵育18h)，而VHL-SF2本身不影响BRD4水平(图4B);在这些条件下，BRD-SF2和VHL-SF2没有显示出细胞毒性。与BRD4 HiBiT实验一致，BRD-SF2在不同浓度下也能诱导内源性BRD4降解，程度相似(BRD4长异构体Dmax:
50%，图4C)。在BRD-SF2存在的情况下，BRD4在用蛋白酶体活性抑制剂或NEDDylation抑制剂(分别为epoxomicin和MLN4924)处理时不会降解，这证明蛋白酶体和 Cullin E3 连接酶依赖机制与VHL的招募一致(图4D,E)。为了进一步证实VHL-SF2在结合到PROTAC中时能够招募VHL诱导靶蛋白降解的多功能性，基于已知的AR配体合成了两种AR配体衍生的VHL-SF2偶联物AR-VHL-SF2和AR2-VHL-SF2，这些配体具有不错的细胞效力，之前已经被加入到AR双功能降解剂中(图4F)。在LNCaP前列腺癌细胞中使用AR HiBiT实验来评估这些化合物诱导AR降解的能力，其中内源性AR用HiBiT肽标记(图4G)。ARVHL-SF2-和AR2 - VHL- SF2介导的蛋白降解均依赖于蛋白酶体和E3连接酶，基于环氧霉素或MLN4924存在下的AR降解阻断(图4H,I)，并且在这些条件下不表现出细胞毒性。![]()
图4. BRD-SF2的结构以及作用机制探索
为了进一步研究共价VHL配体的潜在优势，在冲洗实验中对BRD-SF2和MZ-1进行了正面比较。在本实验中，与MZ-1相比，BRD-SF2的降解活性相对下降较少(图5A,B)。在竞争浓度的VH032（VHL配体）的情况下，BRD4 HiBiT实验证实，在6h时，MZ-1对BRD4的降解明显更受VH032的影响更大(图5)。这些结果进一步支持了BRD-SF2的共价作用机制，并验证了在去除游离PROTAC或存在竞争结合物后延长降解活性的潜力。![]()
图5. BRD-SF2和MZ-1的对比实验
这是首次报道缺乏羟脯氨酸基团并通过磺酰氟分子与VHL共价结合的VHL配体，也是首次通过设计而非筛选开发的共价E3连接酶结合剂。当与双功能降解剂结合时，得到的基于磺酰氟的PROTACs能够诱导蛋白酶体和泛素连接酶依赖的BRD4和AR的TPD。与非共价PROTACs的标准三元配合物相比，共价E3连接酶招募物在预测的二元配合物的催化效率和延长功效方面具有优势。总之，该文章为VHL在TPD中的共价招募奠定了基础，并为进一步优化VHL共价配体以提高其效力和稳定性提供了药物化学基础。此外作者还报道了BRD4和AR的新型双功能降解物，这些降解剂可作为开发具有更好药代动力学和药效学特性的PROTACs的起点。原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c02123
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