分享一篇2024年5月3日Online的综述，旨在为TPD研究及开发者提供些许灵感，或许有助于一款新分子胶药物的产生！——济世妙方
批准沙利度胺类药物的二十年时间里，已有许多有前途的候选药物出现，它们作为靶向蛋白质降解剂具有显着的活性。而用于降解“不可成药”靶蛋白PROTAC的出现增强了对Cereblon高亲和力、选择性和类药性改造的需求。然而，沙利度胺及其批准的衍生物仍然存在一些问题，例如结构不稳定和溶解度差。于是，作者对解决这些问题的策略进行了综述，并重点介绍了当代药物发现方法，以及通过这些方法产生的新型沙利度胺类似物。
现代医学史上也许没有比沙利度胺的历史更跌宕起伏的药物了。沙利度胺曾因上市后在全球范围内引发灾难性的婴儿出生缺陷（反应停事件）而受到诟病，但现在它已成为治疗血液瘤重磅炸弹药物家族（来那度胺为沙利度胺的衍生物）的典型成员。沙利度胺于1953年首次被合成，作为治疗孕吐的镇静剂和止吐剂于1957年上市。早期的动物研究证明该药物无毒（用小鼠无法观察到LD50），直到1961年，沙利度胺被证实是一种强效致畸剂。据估计，全世界大约有1万名儿童出生时患有畸形，其中40%无法活到一岁。如果不是3年后偶然发现沙利度胺也是一种强效抗炎药，那么沙利度胺很可能早已作为一种命运多舛的废弃药物而黯然失色。在世卫组织资助的一项具有里程碑意义的治疗麻风结节性红斑（ENL，麻风病并发症）的临床试验后，沙利度胺被批准作为ENL的一线治疗药物。这一发现激起了人们对该药的新兴趣。几十年来，它被发现可以用于抗血管生成和免疫调节。后来，沙利度胺还被用于治疗复发或难治性多发性骨髓瘤（MM）。然而，这种用法现在已被统称为免疫调节药物 (IMiD) 的沙利度胺第二代衍生物所取代，因为IMiD来那度胺和泊马度胺具有更好的药代动力学性质，并在治疗MM患者时显示出更小的不良反应。
在沙利度胺研究的早期阶段，C4和C5的简单官能化、C2羰基的缺失、戊二酰亚胺环的开环和改善的水溶性是成药性优化的前沿。由于缺乏对沙利度胺生物靶点的认知，基于结构的合理药物设计无法实现，长期以来，IMiD的致畸和免疫调节作用的作用机制也仍然是个谜，直到2010年Ito和同事最终确定了一个假定的作用靶点。他们的研究表明，IMiD与Cereblon (CRBN) 结合，而Cereblon是E3泛素连接酶复合物cullin-RING连接酶4 (CRL4) 的底物受体。此后不久，研究者又证明了IMiD结合CRBN与骨髓瘤细胞中的治疗效果有关。现在大量证据表明，沙利度胺及其衍生物通过与CRBN特异性结合来发挥作用，诱导目标靶蛋白被泛素化，从而被蛋白酶体降解。此外，沙利度胺衍生物之间的结构差异导致其可降解的目标靶蛋白的不同，从而产生每个IMiD的独特生物活性。例如IMiD降解转录因子蛋白IKZF1和IKZF3对于MM治疗的功效至关重要，这反映在沙利度胺、来那度胺和泊马度胺的相对效力中，与它们诱导IKZF1/3 降解的能力对应。同样，来那度胺在早期IMiD中的独特之处在于其降解酪蛋白激酶 (CK1α) 的能力，这一特性赋予其治疗5q缺失骨髓增生异常综合征 (MDS) 的功效。同样，来那度胺在早期IMiD中的独特之处在于其降解酪蛋白激酶 (CK1α) 的能力，这一特性赋予其治疗5q缺失骨髓增生异常综合征 (MDS) 的功效。
最初，沙利度胺的致畸性被认为是自由基和DNA损伤（如在沙利度胺暴露的兔子胚胎中观察到的）或血管生成抑制的结果。后来，由于依赖CRBN的IMiD作用机制出现，人们发现IMiD降解新的靶蛋白（如 SALL4、TP63 和 PLZF），降解这些蛋白将导致人的肢体、耳朵和其它缺陷。例如，已知SALL4基因的功能丧失突变会导致先天性出生肢体缺陷，与沙利度胺胚胎病中出现的缺陷相似。研究证明，沙利度胺暴露会导致SALL4在体外和体内的强烈降解，使得兔胚胎的肢体缺陷。这些研究表明，沙利度胺会在人类、灵长类动物和兔子中诱导SALL4降解，但不会在啮齿类动物或鱼类中引起降解。在小鼠中，这种对SALL4降解的不敏感性可以通过用异亮氨酸取代缬氨酸391（人类为387）的单点突变来解释。与致畸性相关的推定降解靶蛋白的发现表明，不降解这些靶蛋白的沙利度胺衍生物可以避免此类药物典型的致畸作用，但到目前位置，避开降解这些致畸靶蛋白的高选择性药物还没有被发现。很明显，简化的动物模型无法完全检查到这一系列问题，因此，尽管我们对致畸机制的了解有所加深，但新型沙利度胺衍生物的安全性验证仍然至关重要。
Celgene公司（现为BMS的一部分）正在进行的药物发现项目已经提供了几种第三代CRBN调节药物 (celMOD)，其中包括结构更复杂的化合物，如iberdomide (4)，mezigdomide (5)，CC-885 (6) and CC-90009 (7)。值得注意的是，化合物7是GSPT1的高度选择性降解剂，GSPT1是一种与急性髓系白血病 (AML) 相关的翻译终止因子。与之前偶然发现的降解靶蛋白不同，化合物7是通过旨在识别潜在抗AML药物的表型筛选方法获得的，这证明了从沙利度胺出发，重新设计一类新型分子胶，用于治疗现有IMiD无效的或其它癌症是可行的。分子胶简单的定义：稳定蛋白-蛋白相互作用 (PPI) 的分子，CRBN 和降解的靶蛋白之间的这种 PPI 稳定性现已得到很好的证实。最近，Lander和同事通过详细的冷冻电镜研究揭示，celMOD不仅结合着CRBN和降解靶蛋白之间，而且还能以变构方式将CRBN构象从开放状态（非活性状态）调节到其典型的封闭状态（活跃状态）。因此，较新的celMOD（例如4和5）在IMiD耐药的MM中仍然有效，因为它们能够更好地诱导这种闭合活性构象产生：与mezigdomide结合的复合物100% 采用闭合状态，伊伯度胺为80%采用闭合状态，泊马度胺仅20%采用闭合状态。
这增强了我们对celMOD分子胶如何发挥作用的理解，使得靶向蛋白质降解作为通用治疗平台快速发展起来。蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 是异双功能小分子降解剂，其特征是E3泛素连接酶配体通过Linker连接上目标靶蛋白的高亲和力配体。故，PROTAC可通过蛋白体降解途径来下调我们感兴趣的任何蛋白质，包括以前无法设计传统抑制剂的不可成药的靶蛋白。利用CRBN配体IMiD的PROTAC现在经常出现在文献中，越来越多的该类PROTAC被推进II期临床试验。同时，研究者开利用沙利度胺与现有药物中的药效团分子片段进行组合，并利用蛋白质组分析来筛选（以基于细胞的表型筛选为指导），以期实现分子胶的合理设计。不幸的是，所有IMiD及其衍生物所共有的母核都存在不良特性，这些特性可能会阻碍构建新的celMOD分子胶。这些问题包括水溶性差、在血浆中易水解以及对应异构体之间不同的多效生物活性，而外消旋体的存在使情况变得更加复杂。在这篇综述中，我们重点介绍了celMOD和分子胶候选药物领域的最新设计趋势，包括提高CRBN亲和力和更通用的类药性的实用解决方案，以及近期新颖有趣的沙利度胺衍生物作为E3配体开发CRBN调节剂或新型抗癌剂的例子。我们希望这项工作简洁、务实的帮助在新药发现项目中使用沙利度胺作为分子胶或PROTAC开发的药物化学家。
设计新分子胶化合物库的方法
当与CRBN结合时，IMiD结构的大部分被埋在包含三个色氨酸残基的浅疏水结合袋内，仅留下部分芳基暴露在溶剂中。因此，沙利度胺的4、5、6和7取代位是添加与降解靶蛋白相互作用配体的理想位点。在邻苯二甲酰亚胺型配体中，由于邻苯二甲酰亚胺的对称性，其中两个位置是等效的，但异吲哚啉配体（如来那度胺）的情况并非如此。6和7取代位功能化的异吲哚啉分子胶在文献中很少见，这个方向是存在探索机会的。通过在初始邻苯二甲酰亚胺前体上设置方便合成的基团，可以通过模块化方法快速合成此类芳基官能化IMiD衍生物的化合物库，然后通过后期官能化对其进行迭代修饰。除了来那度胺和泊马度胺公认的4-氨基之外，以此方法使用的官能团还包括苯酚和苯硫酚、苄基甲基、硼酸酯和芳基卤化物。卤代沙利度胺作为模块化前体化合物在药物发现中的应用是我们小组在该领域的主要贡献，由于其与各种过渡金属催化的交叉偶联反应的相容性，使得它们特别强大。迄今为止，我们的团队已将溴化和碘化沙利度胺前体应用于许多此类反应方法，允许设置芳基和杂芳基环、各种胺、醚和硫醚以及烯桥和炔桥部分。相反，邻苯二甲酰亚胺氟化沙利度胺衍生物在氟化位点与亲核试剂进行简单的SNAr取代，提供了另一种灵活和模块化的路线。
沙利度胺新型分子胶的设计方法通常可分为三大类：表型筛选、基于降解蛋白的筛选和分子杂交（组合化学方法）。表型筛选通常涉及针对目标疾病类型的细胞或动物模型的生物测定，使用针对疾病（例如癌细胞增殖）的测试来优化化合物，而不需要直接表征或量化靶蛋白的降解。因此，该技术对于扩大沙利度胺衍生物适应症（用于治疗原始IMiD并不治疗的癌症类型）特别有效。此外，如果此类药物对传统IMiD治疗不敏感的特定疾病模型表现出有效，那么可能涉及一种新颖的非经典作用机制（可能降解其它靶蛋白）。从这里开始，可以采用全局蛋白质组学筛选来识别任何受影响（下调或降解）的新靶蛋白。此外，可以同时测定多个细胞系以监测非特异性细胞毒性，或鉴定更具选择性的化合物。我们的团队最近展示了这样一种策略，用于开发针对肝癌的高选择性抗癌药物。针对致瘤性和非致瘤性肝祖细胞进行表型筛选，得到仅在致瘤性肝细胞系中表现出抗增殖和抗迁移作用的化合物8和9。同样，研究人员报告了一系列含硫醚的来那度胺类似物，如化合物10和11，对多种淋巴瘤、AML和MM细胞系有效。针对正常人外周血单核细胞 (PBMC) 的交叉筛选实验排除了非特异性细胞毒，并证实了这些候选药物具有良好的安全性。
当一种或多种降解靶蛋白被识别时，基于目标靶蛋白的筛选可以帮助潜在分子胶从命中到先导的优化。由于对CRBN的高亲和力不一定对应于更有效的降解剂，因此必须量化蛋白质降解水平。降解效力的典型指标是DC50和Dmax（即，分别为50%靶蛋白降解所需的配体浓度和观察到的靶蛋白降解的最大百分比）。DC50在低纳摩尔范围且Dmax> 90%的化合物被认为是理想的。这些测量通常使用免疫印迹技术进行量化，最近使用荧光PPI (fluoppi)测定可以提供活细胞中三元复合物形成的时间依赖性可视化。也可以进行基于分子胶的SAR研究来筛选靶蛋白之间的选择性。目前，该策略最成功和最多产的例子是用于治疗AML的高选择性GSPT1降解剂。第一个报道的GSPT1降解剂：CC-885，由于不可接受的毒性而未被推进临床，因为其被认为脱靶降解包括 IKZF1/3和 CK1α 在内的多种靶蛋白。自发现以来，研究者通过基于靶标的筛选进行结构优化已产生了许多有前途的候选化合物，其有效性和选择性显着提高（化合物12-16）。优化的结构特征包括脲接头、苄基间隔基、芳环取代基、额外芳基单元的插入以及IMiD配体的选择（沙利度胺、来那度胺和avadomide）。重要的是，两个独立的研究发现，利用很少使用的异吲哚啉6取代位会产生更有效的GSPT1降解剂，如13和14。除了GSPT1之外，多个小组的类似筛选工作流程也成功优化了来那度胺作为CK1α降解剂的有效性。例如，DEG-35 ( 17 ) 是 CK1α (DC50 = 1.4 nM，Dmax = 84%) 和 IKZF2 (DC50 = 4.4 nM，Dmax = 92%)的双重降解剂，Rankovic最近公开了SJ3149，这是一种更具选择性的 CK1α降解剂，具有更高的有效性（DC50 = 3.7 nM，Dmax = 95%）。
鉴于IMiD具有广泛的抗癌和免疫调节作用，与各种其它治疗作用的分子杂交历来是一种流行且成功的设计方法。这种药效团的连接与基于CRBN的PROTAC形成鲜明对比，因为仅保留互补结构中最少的必要结构部分，具有最少或没有连接Linker，通常确保较低的分子量和更优的类药性、细胞渗透性的候选化合物。例如，GSPT1降解剂15通过调整已建立的药效团进行合理设计，无需灵活的连接Linker。或者，可以替换戊二酰亚胺以消除与CRBN的结合；许多仅保留邻苯二甲酰亚胺部分的IMiD杂合体仍然通过独立机制保持抗炎活性，从而避免了致畸的可能性（对几种仅邻苯二甲酰亚胺沙利度胺类似物的体内胚胎病研究表明了可行性）。此类化合物包括与用于治疗镰状细胞性贫血的一氧化氮供体的混合物、与用于治疗2型麻风反应的镇痛剂的混合物以及与递送神经保护剂的乙酰胆碱酯酶抑制剂的混合物。最近的含戊二酰亚胺的例子同时包括细胞毒性三唑并喹喔啉核的杂交，以产生具有与多柔比星相当的抗增殖活性的抗癌候选药物，以及纳摩尔活性的人中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，其来源于将1,3-氮杂环丁烷二酮部分直接融合到来那度胺的4-氨基上（分别为19和20）。与此同时，Kuchta及其同事最近的研究详细介绍了一种优雅的合成方法，用于获得iberdomide(4 ) 的三支链衍生物，如化合物21，其具有游离羧酸，可实现进一步的功能化。虽然这种化合物最初设计时考虑了PROTAC合成，但这种前体也可以利用分子杂交技术来提供新型iberdomide杂化物。
结构修饰以提高化合物稳定性和溶解度
由于IMiD的C3'立体中心位于羰基的α-位，因此很容易通过酮-烯醇互变异构现象发生外消旋化。对于沙利度胺，这个过程在生理条件下（ 血浆中t1/2 = 1 小时）非常容易发生。鉴于IMiD (S) 对CRBN的亲和力比其 (R)至少高十倍，这对设计基于IMiD的新型分子胶提出了挑战。现在已证明了几种方法可以通过 C3'-立构中心或其周围的结构修饰成功地防止外消旋化。最早的尝试是用甲基或氟原子取代不稳定的手性质子，以分别提供戊二酰亚胺配体22和23。尽管具有这些修饰的化合物已成功地作为药理学工具来帮助阐明对应异构体之间的生物学差异，但这些修饰尚未在目前基于celMOD 配体的分子胶中应用，它们的临床相关性仍不清楚。最近，美国制药公司DeuteRx提出的C3'-氘代衍生物重新出现（24）由于氘质量的增加，C-D键的振动能相对较低（基态能也较低），导致断键所需的活化能增加，有效消除了体内外消旋化。这种修饰现已成功整合到多种IMiD中，包括来那度胺和avadomide。此外，这些氘代IMiD对开环水解也更稳定，并保持与其母体药物相同的药代动力学特征。或者，也可以通过羰基本身的等排取代来避免不需要的互变异构（25）。富含sp3的氧杂环丁烷部分的设置对整体类药性具有有利的影响，包括亲脂性、水溶性、增加的 F sp3和在人血浆中水解的稳定性。最后，最新的策略是通过用氮原子替换来简单地从配体上完全去除立体中心。在基于沙利度胺的PROTAC的优化过程中，Rankovic 和同事将沙利度胺替换为非手性N-苯基二氢尿嘧啶部分（26）。除了减轻对立体化学的担忧之外，具有这种新CRBN配体的PROTAC候选物在溶液中的水解稳定性高出四倍以上 (t1/2 > 48 h)，并且他们的沙利度胺衍生物比基于CRBN配体的活性高出700倍。即使不用于PROTAC，这种N-苯基二氢尿嘧啶配体也比沙利度胺具有改进的性能，使其成为设计新型分子胶和抗癌剂的绝佳起点，并有空间在其非功能化苯环周围引入新型取代基。
IMiD的外消旋化很容易发生，因此许多研究也表明对应异构体之间在体内具有独特的生物活性，这似乎是自相矛盾的。最近，Tokunaga、Shibata及其同事提出了这一难题的潜在解决方案，涉及对映异构体的自歧化 (SDE)，通过形成相对于初始状态具有不同对应异构体富集水平的级分来转化任何对应异构体富集混合物。Shibata等人证明了沙利度胺在生理条件下对SDE的这一过程很敏感：通过手性HPLC监测，他们发现(R)-沙利度胺在磷酸盐缓冲液中的20% ee溶液在37 °C下仅1小时后自发增加到98% ee。同样，相同条件下5% ee溶液增加至61% ee。结果发现，单独使用时，(R)-和(S)-沙利度胺的溶解度是相应外消旋体的五倍以上，另外对每种形式的X射线晶体结构分析也揭示了最短的分子间戊二酰亚胺 H -外消旋异源二聚体中存在键合距离。根据这些数据，该小组提出异源二聚体和同源二聚体存在于溶液中，但是，尽管同源二聚体是瞬时的并且与其单体平衡存在，但外消旋异源二聚体的稳定性增加和溶解度差导致它们持续存在并积累。这些二聚体要么从溶液中沉淀出来，要么具有足够差的吸收和分布特性，以致它们无法以任何有临床意义的浓度进入体内。这反过来使得所使用的沙利度胺的剩余部分成为同源二聚体及其单体的对应异构体富集混合物，能够被吸收并发挥药理作用。
除了构型和水解稳定性之外，溶解度差也是开发基于IMiD的新型候选药物中同样常见的障碍。据报道，沙利度胺、泊马度胺和来那度胺的水（缓冲盐水）溶解度非常低：分别为 62、85 和 111μM ，这导致治疗相关剂量下的生物利用度较低，并且清除率极高，与药物代谢相比，吸收是限速步骤。来那度胺的异吲哚酮核心比其它酰亚胺具有更少的π共轭，因此极化更强，从而以降低膜渗透性为代价提高水溶性（这也有助于解释来那度胺中枢神经系统暴露和副作用的减少）。Rankovic和同事的研究表明，用化合物27中的简单氨基苯基部分取代异吲哚啉，溶解度进一步增加了近50%，并且这种修饰可以很容易地应用于他们最新的二氢尿嘧啶部分26，提供具有改善的溶解度和水解稳定性的外消旋配体。此外，研究还表明任何含戊二酰亚胺的CRBN配体都可以通过其酰亚胺氮与简单氨基酸酯的缀合而转化为高度可溶的前药。化合物28-30均表现出>300 mg/ml 的水溶性，并且可以根据侧链选择调整水解半衰期（对于28-30，t1/2 = 21、12 和 54 分钟）。
扩大分子胶化学空间：环状酰亚胺作为最小CRBN药效团
CRBN识别的天然降解决定子最近被鉴定为由蛋白质链断裂形成的环状酰亚胺（特别是天冬酰亚胺和氨基戊二酰亚胺）。此外，所有目前已知的由分子胶招募的靶蛋白似乎都以相同的方式与CRBN-IMiD复合物相互作用，通过与高度特异性氢键网络的保守β-发夹氨基酸序列相结合。环状酰亚胺是CRBN结合所需的最简单的结构，这一发现可能有助于合理的药物设计。由于对CRBN相互作用有了更全面的了解，人们越来越重视超越通用IMiD配体，发现新的CRBN配体化学结构。为此，Boichenko和同事最近使用一种基于 FRET的测定法对CRBN配体化学空间进行了彻底的SAR研究，该测定法利用了色氨酸残基的固有荧光，其中色氨酸残基包括CRBN酰亚胺结合位点。这证实了戊二酰亚胺是沙利度胺中最小的CRBN结合药效基团，并发现了许多具有合理亲和力的相关环状部分，例如尿嘧啶 ( 31 )、琥珀酰亚胺 ( 32 ) 和乙内酰脲 ( 33 )。有趣的是，四到六元环都是可以接受的，其中五元环最合适。琥珀酰亚胺的亲和力是戊二酰亚胺的六倍。然而，删除一个羰基以得到相应的内酰胺的接受性很差，而与类似的硫代内酰胺的等量氧-硫交换完全消除了与CRBN的结合。此外，在酰亚胺羰基上引入单个取代基α-（如沙利度胺）通常会提高亲和力，而该位置的两个取代基则不能很好地接受。
几个成功的药物发现研究已经产生了结构多样的CRBN调节剂，其特征是环状酰亚胺单元，但在其它方面与沙利度胺及其现有衍生物仅具有较小的相似之处。例如，El-Zahabi及其同事报道了一系列基于噻唑烷二酮和恶二唑的化合物，其在肝脏 (Hep-G2)、结肠 (HCT-116)、前列腺 (PC3) 和乳腺 (MCF-7) 癌细胞系中的细胞毒活性比沙利度胺有所改善。这些化合物是通过将沙利度胺的配体分解为关键药效团特征而设计的：戊二酰亚胺、小空间五元环和疏水性芳基单元。与沙利度胺相比，恶二唑34还可以更大程度地抑制关键的血管生成和免疫调节介质血管内皮生长因子 (VEGF)、肿瘤坏死因子 (TNF)-α 和核因子 (NF)-κB。然而，这项研究没有测试CRBN对这些化合物的亲和力，也没有证实CRBN在其分子作用机制中的直接作用。Heim和同事也采用了类似的方法，受沙利度胺开环水解产物的启发，沙利度胺的邻苯二甲酰亚胺单元被线性酰胺连接体取代（35）。其中一些化合物用琥珀酰亚胺取代了戊二酰亚胺，对CRBN结合产生了不可预测的影响。这可能是由于与CRBN结合时，连接在戊二酰亚胺上的取代基与琥珀酰亚胺的出口位置略有不同，这意味着，为了受益于琥珀酰亚胺增加的亲和力，候选药物的其它官能团可能需要根据具体情况重新定位，以更好地匹配其等效的基于戊二酰胺的降解剂的结合模式。最近，Teng等人报道了一个含三唑的分子胶库，该库采用戊二酰亚胺作为CRBN招募固定的氨基酸序列（靶蛋白含有的）。这些三唑可以通过铜催化的叠氮-炔环加成 (CuAACs) 从常见的叠氮戊二酰亚胺前体快速获得。噻吩取代的衍生物FPFT-2216 ( 36 ) 因其降解磷酸二酯酶 6D（PDE6D）以及先前已知的靶点IKZF1/3和CK1α的能力而受到关注。FPFT-2216的迭代SAR研究得到了PDE6D 和 CK1α 的高选择性降解剂TMX-4100 ( 37 ) 和 TMX-4116 ( 38）。最后，Baran团队用于构建杂芳基连接的戊二酰亚胺的新型电化学合成平台提供了一种快速而温和的方法来构建多种含戊二酰亚胺的配体，增加了未来此类结构的可及性。
结束语
尽管沙利度胺及其第二代IMiD衍生物仍然是最畅销的治疗药物，但正在进行的研究已经为进一步改进这种独特的药物配体提供了许多有希望的途径。药物化学家现在可以采取一些策略来克服沙利度胺的一些不足，包括水溶性差和构型不稳定的手性中心。BMS和其他独立研究小组的持续开发已经产生了各种扩展的邻苯二甲酰亚胺配体，其作为抗癌药物的活性和选择性显着提高，而相反的策略导致了结构多样的含戊二酰亚胺的化合物，这些化合物平衡了高CRBN亲和力与改进的类药性。
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https://doi.org/10.1016/j.drudis.2024.104010
