靶向蛋白质降解已成为针对导致疾病蛋白的化学生物学和治疗干预的一种强大的新模式。绝大多数 PROTAC 降解剂都会选择两种 CRL 之一的活性：von Hippel-Lindau Cullin 2 连接酶复合物 (CRL2 VHL ) ( 12 - 14 ) 和 cereblon Cullin 4 连接酶复合物 (CRL4 CRBN )，利用内源泛素-蛋白酶体系统的活性来诱导靶蛋白的泛素化和随后的降解。然而，迄今为止公开的大多数关于PROTAC三元复合物的结构、生物物理和机理研究仅限于CRL的底物受体/适配器成分，因此缺乏完全组装的催化活性CRL复合物。此外，PROTAC 介导的泛素化的机制和结构研究仍然很少或分辨率有限。为了充分实现和指导降解剂药物的设计和优化，越来越需要了解降解剂如何招募整个天然催化酶来阐明其作用机制。近日，Alessio Ciulli团队在bioRxiv上发表了题为Mechanism of degrader-targeted protein ubiquitinability的研究论文，其团队通过结合冷冻电镜结构、交联捕获策略和泛素化赖氨酸的生化鉴定，确定了整个 PROTAC 诱导的 Cullin 2 RING 连接酶 VHL 催化机制的结构和机制，以及它如何在其高度特异性的情况下催化泛素化。为了实现快速、有效和深度的靶标降解，降解剂不仅必须在低浓度下稳定、长寿命的复合物中招募靶标，而且还必须将其有利地定向到催化位点。除此之外，该团队工作表明，“轻面”内的一个或多个赖氨酸残基在距离和几何形状方面正确定位以驱动高度特异性和高效的泛素化也很重要。![]()
图1 该研究揭示的靶蛋白“泛素化”结构和机制特征示意图
降解剂介导的三元复合物的结构和机制特征直接影响降解剂的药理活性，因此代表了基于合理结构的药物设计的重要优化种类。多项研究表明，在大多数情况下，热力学协同、稳定且动力学寿命长的降解剂介导的三元复合物支撑着降解剂的高效和选择性蛋白质降解特征。然而，三元复合物的形成如何影响多蛋白CRL复合物的PROTAC选择性催化机制内的高效和选择性新底物泛素化，迄今为止仍然难以捉摸。为此，决定研究 PROTAC MZ1 的结构和机制，是有效且快速的VHL招募BET降解剂，与其他BET蛋白相比，它表现出优先降解BRD4。为了更深入地了解降解剂的作用机制，我们确定了多亚基催化复合物的结构，该复合物由完整的 CRL2 VHL、负载泛素的 E2 结合酶和作为“新底物”的 BRD4 BD2组成，全部组装在一起以 MZ1 为代表的 PROTAC 降解剂。CRL2 VHL是一种150 kDa E3 连接酶，由五个亚基组成：底物受体 von Hippel-Lindau（短亚型 VHL19，18 kDa 或长亚型 VHL30，24 kDa）、接头蛋白 Elongin C（EloC，12 kDa）和 Elongin B (EloB，15 kDa)、Cullin 2 支架 (Cul2，87 kDa) 和 RING 盒蛋白 1 (Rbx1，12 kDa)。VHL-EloC-EloB (VCB) 被募集到 VHL 和 EloC 之间界面处的 Cul2 N 末端。在 cullin 2 的 C 端结构域，E1 NEDD8 激活酶 APPBP1-UBA3 和 E2 NEDD8 缀合酶 UBE2M 与 NEDD8 E3 连接酶 Rbx1 一起作用以 neddylate Cul2，即共价修饰 Cul2 WHB 结构域的 K689 残基NEDD8。这种修饰已被证明可以诱导 cullin-RING 复合物的构象重排，并促进 E2 泛素结合酶的结合。因此使用冷冻电镜 (cryo-EM)确定完全活跃的 NEDD8-CRL2 VHL与 BRD4 BD2的结构。该课题组用~4.0 Å分辨率的冷冻电镜结构首次有机会了解新底物 BRD4 BD2与PROTAC 和全长活性 E3 连接酶复合物的整体构象。全长CRL2VHL-MZ1- Brd4BD2三级结构验证了相对于VHL的新底物的晶体结构，并揭示了系统内微妙的灵活性，允许在底物结合和E3连接酶的催化位点之间的间隙桥接泛素化（图2）。![]()
接下来的目标是确定BRD4溴结构域上的哪些赖氨酸残基最容易被泛素化并成为泛素化的目标。具有 UBE2R1 和 UBE2D2 的体外泛素化产物（也称为 UbcH5b，被认为优先用第一个泛素引发底物）通过 SDS-PAGE 解析，切除 BRD4 泛素化产物的条带，用胰蛋白酶消化，和通过质谱鉴定的K-GG修饰肽。他们一致地鉴定出 BRD4 BD2上的 8个泛素化位点（K333、K346、K249、K355、K362、K368、K445 和 K456）（图3A）。由于 MZ1 对 BRD4 和 BRD2 的泛素化和降解选择性高于 BRD3 ( 13 , 29 , 40 )，因此我们通过不同 BET 蛋白中 BD2 的序列比对检查了已鉴定的泛素化赖氨酸残基的保守性（图3C）。发现 K456 位点在 BET BD2 中严格保守，K346、K349和K368 也是如此，而其他两个残基（K333 和 K445）在普遍表达的 BRD2/3/4 中严格保守，但在 BRDT 上则不然（图3C）。然而，在 BRD4 BD2和 BRD2 BD2中有两个残基位置带有可泛素化的 Lys ，但在 BRD3 BD2中带有非泛素化的 Arg 残基。该分析表明，虽然 BRD4 BD2和 BRD2 BD2相对于 BRD3 BD2的机械选择性的主要贡献者和驱动因素很大程度上取决于三元复合物中新底物的优先识别，但至少部分可能是BRD2/4 中存在这两个泛素化赖氨酸残基（但 BRD3 中不存在）也可能有所贡献。总之，我们的泛素化数据确定了一组可泛素化的赖氨酸，它们位于最接近 Rbx1 的目标蛋白的表面，与存在于相反表面的非泛素化的赖氨酸明显不同。我们还发现单个赖氨酸残基似乎优先泛素化，而总体赖氨酸保守和定位无法清楚地解释 MZ1 对不同 BET BD2 的机械选择性。![]()
图3 BRD4溴结构域在E3连接酶RING结构域可接近的赖氨酸上泛素化。为了更好地了解 cullin RING 连接酶如何介导新底物的泛素化，他们开发了一种方法来捕获与 UBE2R1在 Ub-BRD4 BD2上的活性泛素链延伸相对应的过渡态类似物物种（图4A）。在这个泛素化结构模拟物中，野生型 Brd4 BD2首先在 N 端融合到泛素 (G76S、K48C) 的 C 端，模拟受体泛素 (Brd4 BD2 -Ub A )。UBE2R1（C93K、S138C、C191S、C223S）突变体通过C93K 残基处的稳定异肽键不可逆地装载野生型泛素（UBE2R1-Ub D）。将所得的Ub(G76S, K48C)-BRD4 BD2用小型双马来酰亚胺乙烷 (BMOE) 交联剂生物化学交联至 UBE2R1(C93K, S138C, C191S, C223S)-Ub 的 E2 受体位点附近的 S138C残基并纯化 (BRD4 BD2 - Ub A -BMOE-Ube2R1-Ub D）（图 3A，图 S9）。与 MZ1 和 (NEDD8)-CRL VHL一起孵育后，通过凝胶电泳和质量光度分析观察到完整的复合物形成（图4B-C）。在 (NEDD8)-CRL2 VHL -MZ1-Brd4 BD2 -Ub A -BMOE-Ube2R1-Ub D复合物中，MZ1 和交联底物-E2 缀合物充当N端和C端区域之间的稳定桥梁。CRL2 VHL，目标是将整个复合体包围成一个封闭的“环状”结构。![]()
图4 BRD4 BD2泛素化结构模拟物的组装。
为了解决封闭的完全组装复合体的结构，我们通过冷冻电镜对样品进行了结构研究。课题组特地研究了UBE2R1和BRD4 BD2之间的界面，并测量了与BRD4的泛素化赖氨酸残基的距离（图5）。虽然 BRD4 BD2和 UBE2R1 没有直接接触，但他们观察到，优先泛素化的 K456 直接指向 E2∼Ub 亲电子位点（图 5B）。我们测量了 K456 的 N-ε与 C93处模拟硫酯的羰基之间的距离为 18.4 Å（图5B）。尽管不是最短距离，但 K456 似乎已准备好以最佳几何结构接近 E2∼Ub D上的亲电子硫酯。由于K456 位于溴结构域 C螺旋的 C 末端，远离结合的 MZ1 界面，因此所示的倾斜可能有助于桥接这样的距离。残基 K368 和 K445也都接近 C93，但与 K456 相比，它们更接近 VHL-MZ1-BRD4 BD2界面，并且具有较低的迁移率。基于这些观察，研究者认为它们应该不如 K456 更适合泛素化。该团队的结构工作共同利用交联稳定性来实现全封闭 (NEDD8)-CRL2 VHL -PROTAC-target-Ub A -E2∼Ub D结构的高分辨率冷冻电镜结构，使用溶液内技术对其进行验证这使得对由PROTAC 结合的CRL 机制催化的新底物泛素化获得前所未有的见解。![]()
本文作者：SY
