急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成人最常见的急性白血病。尽管近年来分子靶向治疗取得了进展，但5年总生存率仅为30%左右。这主要是由于频繁的复发或难治性疾病，其预后很差；这些患者的1年生存率仅为10%。作为这种治疗抵抗的主要原因，AML细胞通过多种机制对凋亡诱导产生抵抗，这强调了开发克服凋亡抵抗的替代治疗策略的必要性。
非凋亡途径调控的细胞死亡在癌症研究中受到越来越多的关注。调节细胞死亡的一种形式是铁死亡，其特征是铁依赖性，并由细胞膜上脂质过氧化的积累触发。越来越多的实体肿瘤研究证据支持铁死亡诱导的治疗潜力是通过其独立于凋亡的细胞死亡机制。铁死亡的主要防御机制包括xc-/谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)途径和GPX4的非依赖途径，这些途径利用内源性自由基捕获抗氧化剂，如辅酶Q10(CoQ)或四氢生物蝶呤。其中，GPX4是唯一能够直接还原脂质过氧化物的酶，其抑制的结果是铁死亡。GPX4是一种硒蛋白，其翻译受到一种独特的需要硒的蛋白质合成机制的调控。由于GPX4在硒蛋白合成系统中的重要地位，即使在硒缺乏的情况下，GPX4的表达也相对保留，表明其在细胞稳态中的重要性。
AML细胞表现出活性氧产生和活性铁摄取增加，这两个因素决定了其对铁死亡的易感性。因此，假设铁死亡是AML中的一个脆弱点。虽然铁死亡最近在AML中被研究，但GPX4介导的铁死亡在AML中的病理生理作用仍不清楚。
本研究阐明了GPX4抑制诱导AML中铁死亡的分子机制。在AML细胞中鉴定了线粒体参与的铁死亡，为靶向这种疾病特异性脆弱性以增强GPX4抑制的抗白血病效应提供了分子理论基础。
实验结果1：GPX4是AML潜在的治疗靶点
为了评估靶向包括GPX4在内的铁死亡调控基因在多种癌细胞系中的治疗潜力，本研究结合了423个癌细胞系的CRISPR和shRNA筛选数据的工具shinyDepMap分析了癌症依赖图谱(Cancer Dependency Map，DepMap)数据集。该工具能够预测感兴趣的基因在癌细胞系之间的重要性，以及不同细胞类型之间的基因重要性的选择性。特别研究了在FerrDb上注释的铁死亡抑制基因，FerrDb是一个手动检索的铁死亡调节因子及其疾病关联数据库。GPX4是继mTOR之后，在铁死亡抑制因子的前10位中重要性排名第二的基因(图1A)。此外，GPX4的选择性远高于mTOR，说明GPX4的重要性更具有细胞系特异性。重要的是，当将细胞系按肿瘤类型分组时，AML是高度依赖GPX4的细胞系之一(图1B)。同时，mTOR不仅在AML中表现出高度的依赖性，而且在其他肿瘤类型中表现得更为突出(图S1A)。这些分析提示靶向GPX4可能在AML中具有特定的作用。
接下来检测了GPX4蛋白在AML细胞中的表达。在AML细胞系中，有11个细胞系的表达水平存在差异(图1C)。在检测的16个样本中，原代AML细胞也显示出不同的GPX4蛋白表达水平(图1D)。GPX4在正常骨髓单个核细胞中的表达明显高于AML细胞(图1D，E)。值得注意的是，在一些原发性AML样本中检测到不同水平的GPX4条带，这可能提示该蛋白的翻译后修饰，而一些涂片模式可能反映了GPX4蛋白的部分降解。然而，这些条带的确切性在目前的研究中仍不清楚。因此，使用较大样本量的公开数据集进行了进一步的验证，并分析了GPX4在AML细胞和正常细胞中的差异表达。首先，使用了GEPIA平台，一个用于癌症和正常基因表达谱的Web服务器。结果发现来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据集的AML样本的GPX4基因表达显著低于来自基因型组织表达(The Genotype-Tissue Expression，GTEx)数据集的正常骨髓样本(图S1B)。还分析了最近的一个比较原代AML和正常骨髓细胞的蛋白质组数据集。与之一致的是，与正常骨髓样本相比，GPX4蛋白在AML样本中的表达显著降低(图1F)。
图1 GPX4是AML的潜在治疗靶点
接下来，基于先前的研究表明GPX4基因表达升高对AML患者生存有负面影响，本研究分析了TCGA数据集和Beat AML数据集来研究其相关性。虽然TCGA显示GPX4高表达的患者生存更差(图S1C)，但Beat AML没有显示出明显的生存差异(图S1D)。此外，对一个公开的蛋白质组数据集的分析显示，高和低GPX4蛋白水平的AML患者之间没有显著的生存差异(图S1E)。这些分析并不完全与之前报道的GPX4表达对生存影响的研究相矛盾，但也表明GPX4与AML患者生存的相关性应该更仔细地得出结论。包括混杂因素在内的多个方面可能导致这些不同的结果，需要进一步研究以确定是否存在特定的AML亚群，其中GPX4的表达对生存有影响。
图S1
实验结果2：GPX4抑制在体外和体内诱导AML细胞铁死亡
利用ML210（迄今为止，一个已经确定的、全蛋白质组的GPX4特异性抑制剂）检测GPX4的药物抑制的抗白血病作用。本研究确定GPX4抑制诱导的细胞死亡为Annexin V和/或DAPI阳性的细胞百分比，以捕获凋亡和非凋亡细胞死亡，包括铁死亡。在OCI-AML3细胞中，ML210增加了Annexin V阳性和DAPI阳性的组分，而脂溶性抗氧化剂liproxstatin-1(Lip1)和α-生育酚(aToc)以及铁螯合剂去铁胺(DFO)有效地抑制了ML210的增加(图2A)。这些数据表明，虽然Annexin V通常被用作细胞凋亡的标志物，但Annexin V阳性的AML细胞是由GPX4抑制引起的铁死亡。这与之前的研究结果一致，证明铁死亡后的脂质过氧化可以导致磷脂酰丝氨酸外翻，而不激活Caspase。因此，泛Caspase抑制剂z-VAD-FMK不能抑制ML210诱导的细胞死亡(图2B和S2A、B)。用C11-BODIPY检测到Lip1、aToc和DFO一致抑制ML210诱导的脂质过氧化(图2C)。在MOLM-13和OCI-AML2细胞以及细胞中证实了ML210诱导的铁依赖性脂质过氧化和细胞死亡(图S2C-F)。
接下来，在11种AML细胞系中评估了ML210的疗效。亚微摩尔浓度的ML210在大多数细胞系中诱导细胞死亡(图2D)。当分析图1C上的GPX4蛋白表达时，它们的敏感性与GPX4表达水平呈负相关(图2E)。在所检测的细胞系中，MV-4-11对ML210相对敏感，尽管其GPX4蛋白水平较高，表明其他细胞系特异性机制也可能在敏感性的决定中发挥作用。在免疫印迹试验中，已确定的铁死亡调节剂没有显示出任何独特的特征，可能会增加MV-4-11细胞的敏感性(图S2G，H)。需要对其他分子的进一步研究以及它们的功能分析来阐明所涉及的机制。为了评估内源性GPX4上调对铁死亡的影响，利用硒来增强GPX4的生物合成。添加硒-L-蛋氨酸(SLM)的培养基增加了AML细胞中GPX4的表达水平(图S2I)。进一步构建了多西环素(Doxycycline，Dox)诱导的短发夹RNA(shRNA)构建敲低硒蛋白翻译所需的真核延伸因子硒代半胱氨酸-tRNA特异性(EEFSEC)。Dox诱导的EEFSEC敲低抵消了SLM诱导的GPX4上调(图S2J)，证实GPX4上调是通过增加GPX4的蛋白合成实现的。如预期的那样，在添加SLM的培养基中培养的AML细胞对ML210耐药(图S2K)。图S2L总结了GPX4通过硒蛋白合成抑制铁死亡。
本研究还评估了抑制GPX4在TP53突变的AML细胞系中的抗白血病作用，该细胞系作为AML最具临床挑战性的基因亚型之一的体外模型。ML210在TP53缺失或热点突变的同源MOLM-13细胞中具有相似的疗效(图2F)。另一种GPX4抑制剂RSL-3在这些细胞中也表现出类似的细胞死亡诱导作用(图S2M)。免疫印迹显示，与TP53野生型(WT)细胞相比，TP53敲除(KO)或突变细胞中xCT表达略高(图S2N)。这与之前的报道一致，TP53是SLC7A11的负调控因子，而xCT蛋白水平与这些条件下细胞对铁死亡的敏感性无关。在含有TP53R248H突变的Kasumi-1细胞中敲低突变型TP53也没有改变对ML210的敏感性(图2G)。综上所述，抑制GPX4可独立于TP53突变状态发挥抗白血病作用。
图S2
然后用ML210处理来自AML患者或健康骨髓供体的原代细胞。AML患者包括经过多种方案治疗后复发或产生耐药的患者和/或伴有TP53突变的患者。大部分检测的初治AML样本对ML210敏感(图2H和S2O)。3例样本显示对ML210耐药，但不能确定任何解释耐药的共同临床特征，包括先前的治疗方案、细胞遗传学或突变。AML细胞对ML210的敏感性与初发AML样本中GPX4蛋白水平的相关性分析显示呈负相关(图2I)，这表明GPX4蛋白表达是AML细胞对GPX4抑制敏感性的潜在预测因子。来自健康骨髓供者(HD)的CD45+单核造血细胞诱导的细胞死亡显著低于AML患者样本中诱导的细胞死亡(图2H)。此外，ML210(微摩尔水平)在原代细胞中的有效剂量高于其在细胞系中的有效剂量，其机制有待进一步研究。值得注意的是，在原代细胞中，较高剂量ML210诱导的细胞死亡被Lip1抑制(图S2P)，与铁死亡诱导的靶效应一致。
图2 抑制GPX4可促进AML患者铁死亡
接下来，在OCI-AML3细胞中构建Dox诱导的靶向GPX4的shRNA(sh GPX4 )的OCI-AML3-sh GPX4-1或-2细胞 (图3A)。Dox处理96 h (sh GPX4-1)或72 h(sh GPX4-2)导致脂质过氧化(图3B和S3A)，随后在120 h诱导细胞死亡(图3C)，表明GPX4下调诱导脂质过氧化先于细胞死亡。这一发现在转染相同shRNAs的MOLM-13细胞和OCI-AML2细胞中得到证实(图3D、E和S3B、C)。在Dox处理96小时后，这两种细胞系已经诱导了细胞死亡，这可能部分是由于与OCI-AML3细胞相比，GPX4的基础表达较低。此外，敲低GPX4使OCI-AML3-sh GPX4细胞对ML210的敏感性增加，但该剂量本身并不有效(图3F)，与前述GPX4蛋白表达与抑制GPX4敏感性之间的负相关一致。Lip1和aToc能够抑制GPX4敲低引起的细胞死亡，而DFO不能抑制GPX4敲低引起的细胞死亡(图S3D、E)。值得注意的是，AML细胞由于其固有的抗白血病作用，不耐受DFO用于实体癌铁死亡研究(高达100 μM)的剂量范围(图S3F)。考虑到sh GPX4诱导的脂质过氧化程度比ML210处理更为严重(图3B、2C和S3A)，AML细胞中较低剂量的DFO可能不足以阻断GPX4敲低诱导的铁死亡。
图3 GPX4基因敲低可诱导AML患者体内外铁死亡
为了确定抑制GPX4在体内的抗白血病作用，本研究用荧光素酶标记OCI-AML3-shGPX4-2细胞，并将其移植到NSG小鼠中。通过生物发光成像(BLI)证实定植后，小鼠被给予常规水(溶剂)或四环素以敲低白血病细胞中的GPX4(图S3G)。四环素治疗显著延长小鼠生存期(中位生存期74天vs55天)(图3G)，证实GPX4抑制在体内发挥抗白血病作用。免疫印迹验证了从小鼠中收获的白血病细胞中敲低GPX4蛋白(图3H)。同样的四环素处理并不能延长移植有对照shRNA的OCI-AML3细胞的小鼠的生存期(图S3H)。
图S3
实验结果3：线粒体脂质过氧化和电子传递链复合物调控AML细胞铁死亡
由于线粒体是细胞氧化还原和铁代谢的中心，接下来研究了线粒体在AML细胞铁死亡中的作用。在形态学上，通过透射电子显微镜评估显示，与对照细胞相比，ML210处理的OCI-AML3细胞具有较小的线粒体和电子致密的线粒体基质(图4A)。这与之前铁死亡在非白血病模型中的研究结果一致。ML210处理的OCI-AML3细胞还具有"囊泡"形态的不规则嵴，这一现象类似于在HeLa细胞凋亡诱导过程中发生的发现。在功能上，ML210增加了AML细胞中线粒体超氧化物的产生(图4B、C和S4A、B)，而Lip1、aToc和DFO在很大程度上阻断了ML210的作用。这表明GPX4抑制诱导的线粒体超氧化物大多是铁依赖的脂质过氧化。事实上，Mito Per Ox染色的流式细胞术检测线粒体中的脂质过氧化，发现ML210持续增加线粒体脂质过氧化(图4D)。Dox诱导的GPX4敲低也增加了OCI-AML3细胞和MOLM-13细胞中线粒体超氧化物的产生和脂质过氧化(图4E和S4C、D)。
先前的一项利用小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的研究表明，线粒体靶向抗氧化剂甲磺酸米托醌(MitoQ)在保护细胞免受GPX4抑制诱导的铁死亡中的作用远不如非靶向抗氧化剂癸基泛醌(DecylQ)。这表明铁死亡通常产生于细胞质中的氧化还原失衡，而不是线粒体中的氧化还原失衡。为了进一步研究线粒体在白血病细胞中的作用，比较了MitoQ在MEFs和OCI-AML3细胞中的抗铁死亡作用。通过免疫印迹测定这些细胞中GPX4蛋白的表达(图S4E)。最终证实了在MEFs中阻断ML210诱导的细胞死亡所需的MitoQ的浓度是DecylQ的5倍以上(图4F)，这与之前的报道一致。相反，令人意外的是，在ML210处理的OCI-AML3细胞中，MitoQ与DecylQ阻断铁死亡的能力相当(图4G)，表明AML细胞铁死亡主要受线粒体而非细胞质脂质过氧化调控。除MitoQ外，另一种线粒体靶向抗氧化剂MitoTEMPO也阻断了ML210处理或Dox诱导的GPX4敲低引起的细胞死亡(图4H、I和S4F、G)，进一步证明了铁死亡在AML细胞中的线粒体调控作用。
图S4
接下来，为了研究线粒体氧化还原代谢的中心-线粒体呼吸在AML细胞铁死亡中的作用，研究了电子传递链(ETC)复合物缺乏的AML细胞通过长期暴露于溴化乙啶特异性地消耗线粒体DNA(Rho0细胞)。由于OCI-AML3细胞对Rho0状态不耐受，本研究利用已经建立好的HL-60-Rho0细胞。免疫印迹显示，Rho0细胞中检测不到ETC复合物蛋白(复合物I、II、III、IV中的亚基)，GPX4表达水平较低(图4J)。值得注意的是，HL-60-Rho0细胞对ML210的敏感性是其野生型(WT)对照(HL-60-RhoWT)的近10倍(图4K)。此外，与RhoWT细胞相比，ML210以近10倍的低浓度诱导Rho0细胞发生显著的线粒体脂质过氧化，证实在AML细胞系中，Rho0细胞对GPX4抑制诱导的线粒体脂质过氧化更敏感(图4L)。虽然在Rho0细胞中GPX4的下调也会导致对GPX4抑制的敏感性增加，但推测ETC复合物蛋白的完整表达可能保护AML细胞免受GPX4抑制介导的铁死亡，这在AML细胞中可能是独一无二的。
图4 线粒体脂质过氧化和电子传递链复合物调节AML细胞铁死亡
实验结果4：GPX4抑制介导的铁死亡被线粒体酪蛋白裂解酶P的过度激活协同增强
鉴于Rho0 AML细胞具有更高的铁死亡敏感性，于是研究了联合诱导铁死亡和ETC下调在AML中的治疗潜力。为此，利用咪普利酮类化合物(ONC201或ONC212)超活化线粒体蛋白酶酪蛋白裂解酶P(ClpP)，诱导ETC亚基降解，发挥癌症选择性致死作用。ML210和ONC201联合诱导OCI-AML2和MOLM-13细胞协同死亡(图5A)。联合抗白血病作用与脂质过氧化和线粒体超氧化物产生的累积诱导有关(图5B、C)。接下来研究了协同抗白血病作用是否与GPX4蛋白的变化有关。GPX4的免疫印迹显示，所有ML210处理的样品都发生了蛋白迁移的变化(图S5A)，这反映了ML210或其代谢物的共价结合。同时，在三种AML细胞系中，GPX4总蛋白表达水平的变化是不同的，这表明治疗引起的GPX4蛋白表达的改变不是协同抗白血病作用的主要机制。
组合处理也在初选样本中进行了检验。在ML210单药治疗的14例初治AML样本中，有8例样本(包括1个单独对ML210产生抗性的样品)进行了联合治疗(图2H)。在大多数治疗条件下，联合指数低于1.0，表明具有协同抗白血病作用(图5D)。对于单独对ML210表现出抗性的样品也观察到了协同作用(图5D中用箭头表示)。重要的是，与AML患者相比，来自健康骨髓供体的原代细胞在联合治疗后表现出更少的细胞死亡(图5E和S5B)。
此外，当使用Dox诱导的CLPP-Y118A高活性突变体遗传激活ClpP与ML210结合时，以及当Dox诱导的GPX4敲低与ONC201和ONC212结合时(图5F-H和S5C、D)，诱导了协同的细胞死亡。还检测了GPX4敲低和ONC212在体内的联合抗白血病作用。联合治疗组有延长生存期的趋势，但与其他治疗组相比差异无统计学意义(图S5E)。
为了证明GPX4抑制和ClpP超活化的组合效应，重新分析了之前发表的使用咪普利酮处理的NALM6白血病细胞的CRISPR筛选数据，发现GPX4是最受欢迎的；敲低GPX4使细胞对ClpP超活化更加敏感(图5I)。除GPX4外，硒蛋白合成所必需的基因(SEPSECS、EEFSEC、PSTK、SEPHS2)也是热门基因，表明抑制GPX4的硒蛋白功能对GPX4抑制和ClpP超活化的合成致死性很重要。还发现ONC201对ClpP的超活化上调了GPX4蛋白的表达(图5J)，提示GPX4在AML细胞中发挥了抗线粒体蛋白毒性应激的细胞保护作用。ClpP超活化增强了ETC完整的Rho WT细胞对GPX4抑制的敏感性，但在Rho0细胞中没有发挥协同作用(图5K)。这表明诱导的协同作用依赖于ETC，证明ETC亚基的蛋白表达调节有助于保护细胞免受铁死亡的影响。值得注意的是，对每个ETC复合物(IACS-010759为配合物I,Antimycin A为配合物III,寡霉素-A为配合物V)的药理学抑制并没有增强，而是抑制了ML210诱导的细胞死亡(图S5F)。这些数据表明，单个ETC复合物的功能抑制并不一定能使AML细胞对铁死亡敏感。由于Rho0细胞的特征不仅是ETC功能受损，而且涉及多个复合物的ETC结构消失，因此，通过咪哌啶酮介导的降解失去完整的3D结构和多个ETC复合物的功能可能对诱导协同作用同样重要。
图5 GPX4抑制介导的铁下垂可通过ClpP过度激活协同增强
图S5
越来越多的研究报道了线粒体和ETC复合物在各种癌症模型中对铁死亡的作用，得出了不同的结论。这可能是由于铁死亡具有高度的情景依赖性。本研究的结果表明，在AML细胞中完整的ETC复合物以不同于其他肿瘤类型的方式调节GPX4抑制介导的铁死亡。具体来说，与WT细胞相比，ETC缺陷的HL-60-Rho0细胞对GPX4抑制更加敏感。这与先前的研究表明经典的GPX4抑制剂RSL3在143B骨肉瘤细胞或SK-Hep1肝窦内皮细胞的Rho0状态中具有相似或受损的功效形成了鲜明对比。同样，另有研究报道，在HT-1080纤维肉瘤细胞中，线粒体自噬介导的线粒体耗竭阻断了Erastin诱导的铁死亡，而对RSL3诱导的铁死亡没有影响。针对K562慢性髓系白血病细胞的CRISPR敲除筛选揭示了GPX4缺失和ETC抑制之间的合成致死相互作用。同时，抑制单个ETC复合物反而降低了AML细胞对铁死亡的敏感性。只有当多个ETC的配合物同时被结构上取消的时(通过Rho0条件或ClpP超活化)灵敏度才会增加。值得注意的是，在K562细胞的CRISPR筛选研究中，他们证明了合成致死的相互作用只在细胞与培养基共培养而非常规培养基共培养时观察到，这可能导致了与本研究数据的差异。综上所述，AML细胞可能特异性地依赖ETC来保护自身免受铁死亡的侵袭。
这种ETC依赖的铁死亡保护机制可能是GPX4被抑制的AML中特有的脆弱性。本研究观察到在AML细胞中，GPX4抑制和ClpP激活介导的ETC蛋白降解的组合具有协同抗白血病作用。ClpP不仅靶向ETC蛋白，还靶向其他蛋白，包括参与线粒体翻译或代谢途径的蛋白，抑制这些蛋白可增加细胞对GPX4抑制介导的铁死亡的易感性。之前报道ClpP超活化诱导非典型整合应激反应(ISR)和ATF4上调，最近的研究表明ISR介导的ATF4活化通过改变GSH代谢使细胞对GPX4抑制敏感。这些通路的参与也应在未来的研究中进行评估。然而，在WT AML细胞中观察到的ClpP超活化和GPX4抑制的组合效应，而在ETC缺陷的Rho0细胞中没有观察到，这有力地表明这种协同作用和铁死亡保护机制都依赖于完整的ETC复合物。
此外，本研究证明了MitoQ在AML细胞中具有出乎意料的强抗铁死亡作用，而在MEF细胞中却没有类似的报道。线粒体定位辅酶Q的重要性也与ETC对线粒体脂质过氧化和铁死亡的保护作用相一致，因为ETC复合物将线粒体定位辅酶Q还原成辅酶QH2，从而发挥抗氧化作用。Mito Q已被报道在Erastin或RSL3处理的SK-Hep1肝窦内皮细胞中具有类似的保护作用，其中诱导的铁死亡也与线粒体脂质过氧化有关。此外，最近Boyi Gan课题组的研究表明，线粒体膜上的DHODH和GPD2，都可以与ETC协同调节线粒体定位的CoQ的循环，从而保护细胞免受铁死亡的损伤。虽然这些非ETC辅酶Q调节酶在AML细胞铁死亡中的功能相关性还有待研究，推测维持线粒体辅酶Q的还原形式主要有助于ETC对AML细胞铁死亡的保护作用
本研究使用基因方法阐明GPX4抑制的显著的体内抗白血病活性。目前，尚未有公开上市的GPX4抑制剂因其在动物模型中生物利用度欠佳而被充分开发用于体内研究。开发具有良好体内药代动力学和药效学特征的特异性GPX4抑制剂对于GPX4靶向治疗的临床实施是必要的。同时，GPX4抑制剂在非造血系统中的潜在毒性必须仔细评估，因为基因遗传模型并不能反映全身性的GPX4抑制。我本研究体外数据表明，与正常BM细胞相比，在原代AML细胞中通过抑制GPX4诱导优先的细胞死亡，这可能是由于它们的GPX4蛋白表达水平不同。多种遗传模型也支持GPX4条件性缺失在正常造血和造血干细胞中的耐受性，而最近的一篇文章报道了人正常造血干细胞对铁死亡的敏感性，特别是在体内，值得进一步研究。据报道，GPX4不仅对小鼠早期胚胎发育至关重要，而且与人类发生功能缺失突变时罕见的新生儿致死性疾病Sedaghatian type脊椎干骺端发育不良有关。这些研究提示，抑制GPX4在系统靶向时对其他器官具有潜在的毒性。为了避免潜在的毒性，开发针对GPX4抑制(例如,靶向肿瘤特异性表面蛋白的抗体-药物偶联物)的肿瘤特异性靶向策略将是最有效的方法之一。开发组合策略来最小化GPX4抑制剂的剂量可能是另一种解决方案，特别是通过靶向其他癌症特异性分子机制。结合最近的一项关于GPX4和FLT3在FLT3突变AML中联合抑制的研究，本研究结果表明靶向铁死亡的线粒体调控可以增强GPX4抑制在AML中的治疗效果。
