谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），为含硒GPX家族的第四位成员，是肿瘤细胞铁死亡的关键蛋白。其在胰腺癌、结肠腺癌、肾癌、肺腺癌等多种肿瘤中高表达，被认为是多种癌症的潜在治疗新靶标。但目前仍然缺乏高活性和高选择性小分子抑制剂，尚没有抑制剂进入临床研发阶段。胰腺癌素有“癌中之王”之称，近年发病率呈现逐年上升趋势。胰腺癌生存率极低，预后差，缺乏有效的治疗手段，亟需进行新药、新靶发现研究。
近日，暨南大学药学院李正球研究员、丁克教授、孙平华教授、张章副研究员等作为共同通讯作者在专业TOP期刊Journal of Medicinal Chemistry上发表题为：“Novel Covalent Probe Selectively Targeting Glutathione Peroxidase 4 In Vivo: Potential Applications in Pancreatic Cancer Therapy”的文章（J Med Chem. 2024 Jan 24. doi: 10.1021/acs.jmedchem.3c01608）。作者通过表型筛选结合化学蛋白质组学技术，利用自主开发的含有亲电弹头磺酰亚胺的新型共价化合物库，对胰腺癌多种细胞系展开表型筛选，发现了一种新型、选择性、强效化合物A16，可在纳摩尔水平显著杀伤多种胰腺癌细胞。进一步利用化学蛋白质组学鉴定了A16在细胞体内特异性靶向GPX4，并证明该类共价抑制剂可以诱导胰腺癌细胞铁死亡。![]()
GPX4是一种硒蛋白，对细胞防御、脂质过氧化和缺铁性贫血至关重要；其关键功能包括将脂质氢过氧化物转化为相应的脂质醇，从而为细胞提供至关重要的保护。直接抑制GPX4酶活性可导致细胞内脂质过氧化物水平升高，从而引发铁死亡的发生，这已被证明是杀伤肿瘤的有效方法。然而，由于缺乏明确的活性位点或已知的变构调控位点，GPX4小分子抑制剂的开发一直面临挑战。同时GPX4缺乏适用于常规药物相互作用的结合口袋，并且酶功能依赖于亲核硒代蛋白残基，这表明利用共价抑制剂有可能实现抑制GPX4活性。早期文献报道，使用氯乙酰胺（如RSL3、ML162和C18）作为亲电弹头的小分子被证明是有效的共价GPX4抑制剂（图1A）；但其选择性、活性和药代动力学仍有待提高。因此，开发具有成药性的共价型GPX4抑制剂及其作用机制的探究具有重要的临床研究价值。 表型筛选结合化学蛋白质组学技术是发现全新药物先导化合物和潜在靶标的重要途径；缺乏有效的靶向治疗药物是胰腺癌临床遭遇的严重瓶颈问题。基于上述科学问题，作者首先根据前期开发的炔酰胺（Ynamide）共价弹头（可共价靶向蛋白Cys、Asp和Glu氨基酸残基），发展了系列靶向胰腺癌的小分子共价抑制剂。其中YN-3具有一定的胰腺癌抑制活性（IC50：0.601 μM），以YN-3作为先导化合物优化，作者构建了系列新型炔酰胺共价小分子化合物库（Y1 -Y23，以及A1-A22）。利用该化合物库对胰腺癌细胞系（AsPC-1）进行高通量筛选，发现了A15和A16可在纳摩尔水平显著杀伤AsPC-1，IC50分别为: 266 和22 nM（Figure 2）。进一步对两个化合物在多种胰腺癌细胞系（AsPC-1, CFPAC-1, PANC-1, BXPC-3, MIA PaCa-2, HPAF-II, SW-1990, 和 CAPAN-2）证明了高效杀伤性。 进一步的活细胞标记实验（Figure 4）表明A15和A16在胰腺癌细胞系AsPC-1种具有良好的反应性：时间依赖性（Figure4A）和剂量依赖（Figure4B），以及竞争选择性（Figure4C）。进一步的多种胰腺癌细胞系标记实验和竞争实验（Figure4D）发现A16在多种胰腺癌细胞系中标记均稳定出现在同一位置，说明分子靶标是相同的。洗脱实验（Figure 4E）表明A16这类共价抑制剂可稳定结合靶标，在48小时的监测范围内，标记强度比较稳定。 进一步作者利用化学蛋白质组学技术鉴定出A16的潜在作用靶点为GPX4（Figure 5B）并利用pull-down下拉实验（Figure 5C、D）进行靶点验证。作者还根据已报道的两个GPX4抑制剂ML162和ML210，分别合成相应的含丙炔基探针（ML162-yne和ML210-yne），与A16的标记反应性、结合稳定性进行了比较。结果发现：A16分子能结合与GPX4位点，这一结合能被ML162和ML210竞争性抑制。这表明了A16分子的作用靶点是GPX4是可靠的，同时发现与A16高选择标记GPX4不同的是，ML162-yne和ML210-yne两个探针标记了包括GPX4在内的一系列蛋白（Figure 5F），这可能是两个抑制剂ML162和ML210具有副作用的原因。进一步的使用不含丙炔基的对照分子A8，ML162和ML210与A16分别进行的原位竞争性标记实验（Figure 5G、H）也再次验证了A16分子对靶标GPX4的专一选择性。 鉴于GPX4介导铁死亡引起肿瘤细胞程序性死亡，作者进一步使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Figure 6A）、GPX4抑制剂ML162和ML210（Figure 6B、C、D）以及洗脱实验（Figure 6D和E），分别探究和比较了A16作为GPX4抑制剂在胰腺癌细胞系中的抑制活性。与已有的GPX4抑制剂相比A16表现出良好的抑制活性和抑制长效性，洗脱72小时后对胰腺癌仍有显著杀伤。进一步的GPX4敲除实验（Figure 6F，G）显示，A16在敲低细胞组中活性丧失，反映出A16分子对GPX4靶点的作用专一性。 进一步的体内实验，作者使用AsPC-1构建小鼠荷瘤鼠模型，并使用A16腹腔注射给药（10 mg/Kg，每天1次）。14天后发现给药组肿瘤体积和体重有一定缩减（Figure 7A、C），给药组和对照组小鼠体重大致相当（Figure 7B），表明A16在体内的有效性和安全性；进一步结构改造有望提高其体内药效。进一步的肿瘤组织标记实验以及蛋白下拉实验也说明了A16在体内靶点仍是GPX4。本研究基于表型筛选和蛋白质组学技术，筛选、发现并鉴定了新型、强效、选择性GPX4共价抑制剂（A16），并证明GPX4共价抑制剂可以高活性杀死胰腺癌细胞。该研究为表型筛选结合化学蛋白组学技术用于新药、新靶发现提供了新的范例，也为以GPX4为靶点进行药物开发提供了重要研究基础。
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