度胺靶标确证及其衍生物分子胶设计思考
文摘
2024-05-23 18:53
荷兰
上市初，“反应停事件”的灾难如同一颗重磅炸弹引起世界性轩然大波，也为沙利度胺（Thal）的开发蒙上了一层阴影。随着药物开发技术的发展，由于在多发型骨髓瘤良好药效，于1998年获得FDA批准上市，此后，其衍生物伯马度胺以及来那度胺（Lena）相继获批上市。然而，直至2010年，沙利度胺作用靶标由日本科学家handa教授首次报道[1]。至今，其衍生物作为分子胶的结构生物学工作相继报道，为药物开发带来新的思考。首先，通过pulldown蛋白富集并结合蛋白质谱和凝胶电泳分析，能够被富集的蛋白包括DDB1和CRBN（图1A）。Co-IP证实与Thal互作的是CRBN而非DDB1（图1B），Knockout也进一步证实，CRBN敲除后Thal与CRBN互作逆转。进而IP说明DDB1与CRBN互作（图1D），这也解释了为什么pulldown可同时富集DDB1和CRBN两个蛋白。![]()
进一步通过蛋白截短实验证明，CRBN与DDB1互作的位点在其187-260位氨基酸序列结构（图2A，C），Co-IP证实，相较于野生型CRBN，187-260位氨基酸序列截短后的CRBN与DDB1互作消失。且187-260截短后的CRBN自身泛素化功能丧失。点突变扫描发现，CRBN的384和386位点突变为丙氨酸后，Thal与CRBN互作减弱，而当两个位点完全突变后，互作消失（图3A）。而双突后的CRBN与DDB1, Cul4以及 Roc1的互作依然存在（图3B），且双突后的CRBN并不影响自泛素化（图3C）。综上可以说明，CRBN与DDB1互作结构位于其187-260氨基酸结构，而与Thal互作位点则在384和386两个关键位点，且这两个位点并不影响CRBN与DDB1的结合，也不影响DDB1-Cul4-Roc1复合物的泛素化生物学功能。随着结构生物学的发展，2014年，Thal衍生物Lena与CRBN-DDB1复合物结构得到解析[2]（图4A）。分析其结合模式可见，1） Lena结合位点位于CRBN碳端由W380，W386，W400三个色氨酸形成的一个狭长口袋内（图4B示意结合位置）；2）Lena的戊二酰亚胺结构与CRBN形成三个关键氢键相互作用；3）异吲哚酮结构与CRBN β转角结构疏水相互作用。结构生物学家随后报道了Lena作为分子胶招募CK1α的Lena-CK1α-CRL4CRBN复合物结构[3]，如图5所示，Lena苯并异吲哚酮结构与CRBN、CK1α形成氢键相互作用网络，且CK1α降解决定子β转角的G40位于CRBN V388及苯并异吲哚酮之间，并与V388形成疏水相互作用。点突变的TR-FRET测试中，将388氨基酸突变为异亮氨酸或侧链空间位阻更大的赖氨酸，CRBN通过Lena对CK1α互作显著抑制。为何Lena只能够招募CK激酶家族的CK1α？对此，通过比对降解决定子β转角处的一级序列可见（图6A），CK1α中关键疏水相互作用的G40氨基酸在CK2亚型中为天冬酰胺，这将与Lena形成空间位阻（图6B），进一步TR-FRET测试中发现，点突变G40N将丧失由Lena介导的CRBN对CK1α的互作。随后，基于Lena结构进行结构改造所得实现对不同靶蛋白降解的分子胶相继报道[4]（图6）。CC-885分子中的脲与CRBN形成氢键相互作用网络，并对其链接的芳基结构实现了很好的锚定作用。进而，在其结构基础上通过对脲基结构调整获得的分子CC-90009则在CC-885分子基础上实现了对GSPT1的选择性[5]（图7）。当前，该分子结构生物学基础并未报道，推测是由于脲基结构的优化，改变了与CRBN互作，而在CC-90009分子中，二氟次甲基的结的引入，其SP3杂化改变了整个分子的空间结构，进而实现了对GSPT1的选择性。图6 Lena衍生物CC-885降解GSPT1和IKZF1图7 CC-885衍生物CC-90009选择性降解GSPT11）Thal及其衍生物作为分子胶如何通过CRBN实现底物受体蛋白选择性识别及降解？如图8所示，底物受体蛋白锌指结构域中β转角的一段loop区作为CRBN对底物受体蛋白的降解识别子（G-5至G+2，共8个氨基酸残基），实现在Thal及其衍生物介导下对底物受体蛋白的招募。在此loop结构中，其序列中的甘氨酸具有高度保守性，且在复合物结构中，插入到CRBN碳端的狭窄沟槽内。因此，该互作结构中，可通过调整Thal的苯环处的结构调整互作网络。此外，复合物结构中，CRBN与底物受体蛋白的结合界面也需良好匹配，形成良好的蛋白-蛋白互作（这也是为什么在底物受体蛋白中具有多个锌指结构而只有特定的锌指结构能够作为降解决定子被CRBN识别）。2）Thal及其衍生物类分子胶水在化合物专利上的挑战根据Thal与CRBN互作模式，其结构中戊二酰亚胺形成关键氢键相互作用网络，能够被修饰的位点则位于苯环位置，因此其结构母核具有高度保守性。随着药物研究人员在该领域的布局，可保护的空间逐渐减小。在此，以结构生物学为指导，通过化学结构的调整以实现生物药效学的差异性将为化合物的创造性提供坚实的基础。[1] Science,
2010, 327, 1345-1350[2] Nat. Struct. Mol. Biol.2014, 21, 803–809[3] Nature 532(7597):127–30, 2016[4] Nature 2016, 535, 252-257[5] J. Med. Chem. 2021, 64, 1835-1843
