Chestnut Studying
摘要
Ferroptosis is a form of cell death that has received considerable attention not only as a means to eradicate defined tumour entities but also because it provides unforeseen insights into the metabolic adaptation that tumours exploit to counteract phospholipid oxidation1,2. Here, we identify proferroptotic activity of 7-dehydrocholesterol reductase (DHCR7) and an unexpected prosurvival function of its substrate, 7-dehydrocholesterol (7-DHC). Although previous studies suggested that high concentrations of 7-DHC are cytotoxic to developing neurons by favouring lipid peroxidation3, we now show that 7-DHC accumulation confers a robust prosurvival function in cancer cells. Because of its far superior reactivity towards peroxyl radicals, 7-DHC effectively shields (phospho)lipids from autoxidation and subsequent fragmentation. We provide validation in neuroblastoma and Burkitt’s lymphoma xenografts where we demonstrate that the accumulation of 7-DHC is capable of inducing a shift towards a ferroptosis-resistant state in these tumours ultimately resulting in a more aggressive phenotype. Conclusively, our findings provide compelling evidence of a yet-unrecognized antiferroptotic activity of 7-DHC as a cell-intrinsic mechanism that could be exploited by cancer cells to escape ferroptosis.
铁死亡是一种细胞死亡形式，它不仅是根除确定肿瘤实体的一种手段，而且还因为它为肿瘤利用代谢适应来对抗磷脂氧化提供了未曾预料到的洞察力而受到广泛关注。在这里，作者发现了 7-脱氢胆固醇还原酶（DHCR7）的抗逆转录活性及其底物 7-脱氢胆固醇（7-DHC）的意想不到的促生存功能。尽管之前的研究表明，高浓度的 7-DHC 会促进脂质过氧化反应，从而对发育中的神经元产生细胞毒性，但作者现在发现，7-DHC 的积累在癌细胞中具有强大的促生存功能。由于 7-DHC 对过氧自由基的反应能力要强得多，因此它能有效地保护（磷）脂质免于自氧化和随后的碎裂。作者在神经母细胞瘤和伯基特淋巴瘤异种移植物中进行了验证，证明 7-DHC 的积累能够诱导这些肿瘤向铁死亡抗性状态转变，最终形成更具侵袭性的表型。总之，我们的研究结果提供了令人信服的证据，证明 7-DHC 具有尚未被认识到的抗铁死病活性，这是一种细胞内在机制，癌细胞可以利用它来逃避铁死病。
实验结果1
远端胆固醇生物合成调控铁死亡
为了确定铁死亡的调控机制，我们使用 HEK293T 细胞（一种对 GPX4 抑制剂 1S,3R-RSL3（以下简称 RSL3）具有中等敏感性的转化人胚胎肾细胞系）进行了基于 CRISPR-Cas9 的全基因组筛选。作者将靶向 18,543 个基因的全基因组 sgRNA 文库导入 HEK293T 细胞，并用 RSL3 或 DMSO 处理细胞 8 天（图 1a）。与 DMSO 对照组相比，通过分析 RSL3 处理后存活细胞中富集或耗竭的 sgRNA，作者在抗铁死亡组中发现了几个已知的铁死亡抑制因子，如 SLC7A1126、FSP111、12 和 GCH11415（即靶向这些基因的 sgRNA 被耗竭），这表明作者的筛选系统具有鲁棒性（图 1b）。值得注意的是，包括 MSMO1、CYP51A1、EBP 和 SC5D 在内的多个参与远端胆固醇生物合成的基因也被鉴定为铁死亡的潜在抑制因子（图 1b、c）。利用 STRING27 和基因本体（Gene Ontology，GO）对作者的筛选数据进行的进一步富集分析表明，胆固醇合成簇排名第一，支持了远端胆固醇生物合成途径在铁死亡中的潜在作用。我们还分析了 Cancer Therapeutics Response Portal（CTRP）数据库，发现 CYP51A1、MSMO1、EBP 和 SC5D 的表达与对几种铁死亡诱导剂（包括 ML210、ML162 和 RSL3）的耐受性呈正相关。这些数据共同促使作者假设这些远端胆固醇生物合成基因可能具有潜在的抗铁死亡功能。
接下来，作者证实了在 HEK293T 细胞中单个删除 CYP51A1、MSMO1、EBP 和 SC5D 会增加对 RSL3 和 ML210 诱导的铁死亡的敏感性（图 1d）。铁死亡抑制剂去铁胺（DFO）、铁前列素-1（Fer-1）和依地苯酮（Ide）能有效阻止这种致死性凋亡，但细胞凋亡抑制剂 ZVAD-FMK 或坏死性凋亡抑制剂 Nec-1s 不能阻止这种致死性凋亡。在 SC5D-KO 细胞中重新表达 SC5D 逆转了 RSL3 诱导的铁死亡的严重程度（图 1e）。此外，缺失多不饱和脂肪酸掺入磷脂所必需的促铁血病基因 ACSL4 在很大程度上消除了 SC5D 缺失对 RSL3 诱导的细胞死亡的影响（图 1f）。这些结果表明，包括 CYP51A1、MSMO1、EBP 和 SC5D 在内的胆固醇生物合成远端关键参与者具有共同的抗铁死亡活性。
作者还评估了在全基因组筛选中排名靠前的促败血病候选基因（即针对这些基因的 sgRNA 得到了富集）。值得注意的是，编码将 7-DHC 转化为胆固醇的胆固醇合成末端酶的 DHCR7 在该组中排名第一，甚至高于 ACSL429、LPCAT330 和 KEAP131 等已知的铁死亡介质（图 1b）。作者证实，缺乏 DHCR7 会强烈抑制 RSL3 或 ML210 诱导的铁死亡（图 1g）。此外，重新表达 DHCR7 逆转了 DHCR7-KO 细胞的铁死亡抵抗（图 1h）。
作者接下来研究了胆固醇是否参与了铁死亡的调控。为此，作者评估了在正常培养基中培养的单个胆固醇生物合成远端基因缺失细胞的胆固醇水平。作者的数据显示，单个缺失 CYP51A1、MSMO1、EBP、SC5D 和 DHCR7 的细胞对胆固醇水平的影响很小。此外，在含有正常血清（FBS）或脂蛋白缺乏血清（LPDS）的细胞培养基中直接添加胆固醇对细胞活力的影响也很小。综合来看，作者的数据表明胆固醇并不直接调控铁死亡，这与之前的研究一致。
作者进一步研究了消减远端胆固醇生物合成基因是否会影响已知的铁死亡调控因子。我们的数据显示，缺失 SC5D 或 DHCR7 既不会影响已知铁死亡调节因子的蛋白水平，包括 GPX4、FSP1、DHODH、SLC7A11 和 ACSL4，也不会影响 GSH、Fe2+ 以及抗铁死亡代谢物 CoQ10 和角鲨烯的水平。这些结果表明，DHCR7 的缺失通过一种未知机制保护细胞，该机制可能是远端胆固醇生物合成基因在铁死亡调控中发挥不同作用的原因。
实验结果2
7-DHC 抑制铁死亡
作者接下来研究了远端胆固醇生物合成基因对铁死亡的不同调控机制。众所周知，7-DHC 是主要的中间代谢产物，它可能在 DHCR7 基因缺失后积累，但在参与上游远端胆固醇生物合成的基因缺失后消失。作者证实，DHCR7 基因缺失会显著增加 7-DHC 的水平，而 CYP51A1、MSMO1、EBP 和 SC5D 基因缺失则会降低 7-DHC 的水平（图 2a）。这些信息使作者假设，7-DHC 的丰度可能是远端胆固醇生物合成基因在铁死亡调控中发挥不同作用的原因。为了验证这一假设，作者通过缺失 7-DHC 合成的直接上游酶 SC5D 来阻断 DHCR7-KO 细胞中 7-DHC 的合成，结果发现缺失 SC5D 显著逆转了 DHCR7 缺失对铁死亡的抑制作用（图 2b,c）。相比之下，缺失 DHCR7 并不能抑制 SC5D 缺失细胞的铁死亡（图 2d）。这些数据表明，7-DHC 的丰度对它们在铁死亡中的不同功能至关重要。
为了研究 7-DHC 对铁死亡的保护作用，作者用 DHCR7 选择性抑制剂 AY994433 处理细胞，以提高 7-DHC 的水平。我们的数据显示，AY9944 能有效提高野生型（WT）细胞中的 7-DHC 水平，但不能提高 DHCR7-KO 细胞中的 7-DHC 水平，这证实了它的靶向功效。重要的是，AY9944 能显著抑制 WT 细胞中的铁死亡，但不能抑制 SC5D 或 DHCR7 缺陷细胞中的铁死亡。此外，在因 HSD17B7 或 SQLE 缺乏而导致 7-DHC 生物合成缺陷的 U937 和 SNU-1 细胞中检测到的 AY9944 处理效果甚微。值得注意的是，根据体外 FENIX 试验，在作者用于处理细胞的浓度下，AY9944 几乎不表现出自由基捕获抗氧化活性。7-DHC 在铁死亡中的抗铁锈色素沉着特性得到了使用 cariprazine 的进一步证实，cariprazine 是美国 FDA 批准的一种药物，可以通过靶向 DHCR733 增加 7-DHC 的水平。这些数据共同表明，7-DHC 的积累是远端胆固醇生物合成基因在铁死亡调控中发挥不同作用的原因。
作者接下来评估了 7-DHC 是否是铁死亡的一般抑制因子。作者的数据显示，通过直接补充或 MβCD 包被的方法将 7-DHC 递送到细胞中，可显著提高细胞内 7-DHC 的水平，并能对铁死亡起到强有力的保护作用（图 2e）。相比之下，其他中间产物，如羊毛甾醇（CYP51A1 的底物）、T-MAS（MSMO1 的底物）、zymostenol（EBP 的底物）和 lathosterol（SC5D 的底物）17 对细胞活力的影响很小（图 2f）。7-DHC 对不同诱导剂引发的铁死亡的抑制作用也在更多的细胞系中得到了证实（图 2g）。同样，通过抑制剂 AY9944 或卡尼普拉嗪抑制 DHCR7 也抑制了各种类型癌细胞的铁死亡。总之，这些数据表明 7-DHC 是一种强效的铁死亡抑制因子，并表明控制其胞内丰度的基因可能决定了铁死亡的敏感性。
实验结果3
7-DHC 可抑制磷脂过氧化反应
作者接下来探讨了 7-DHC 抑制铁死亡的机制。磷脂过氧化是铁变态反应的标志，因此作者用 BODIPY 581/591 C11（一种监测脂质过氧化的探针）进行染色，以评估 7-DHC 是否会影响细胞中的磷脂过氧化。作者的数据显示，在 HEK293T 和 HT1080 细胞中，7-DHC 能明显阻止 RSL3 诱导的脂质过氧化反应（图 3a）。值得注意的是，DHCR7 的缺失会降低内源性 7-DHC 的脂质过氧化反应，而 MSMO1、CYP51A1、EBP 和 SC5D 的缺失会增强脂质过氧化反应（图 3b），这与 7-DHC 水平的降低有关（图 2a）。此外，作者的靶向氧化脂质体分析表明，DHCR7 缺乏时，RSL3 诱导的磷脂过氧化显著降低。此外，大多数磷脂的内在水平在 DHCR7 缺乏时没有显著变化。这些数据表明，7-DHC 能有效地保护细胞免受磷脂过氧化的影响。
最近的证据强调了线粒体脂质过氧化在调节铁变态反应中的重要作用。因此，作者评估了 7-DHC 是否也能阻止线粒体脂质过氧化。与之前的报告一致，用 GPX4 和 DHODH 的抑制剂 RSL3 和 brequinar (BQR) 联合灭活 GPX4 和 DHODH 后，线粒体脂质过氧化显著增加。重要的是，7-DHC 可明显阻止线粒体脂质过氧化（图 3c）。此外，SC5D 基因缺失会加剧线粒体脂质过氧化，而 DHCR7 基因缺失则会阻止线粒体脂质过氧化（图 3d）。
作者接下来研究了 7-DHC 如何抑制磷脂过氧化。与其他甾醇相比，7-DHC 的 B 环含有一个独特的共轭 5,7 二烯，而且据报道它是一种高度可氧化的脂质 ，因此作者推测 7-DHC 可能具有防止磷脂自氧化的能力。为了验证这种可能性，我们进行了一项 FENIX 试验 ，发现 7-DHC 而非其他甾醇（如羊毛甾醇、T-MAS、zymostenol 和参与远端胆固醇生物合成的 Lathosterol）具有很强的活性，能以剂量依赖的方式阻止鸡蛋磷脂酰胆碱的自氧化。与之前的报告一致，在脂质体中预装 7-DHC 能显著提高其阻止磷脂自氧化的活性（图 3e）。值得注意的是，将 7-DHC 与麦角甾醇、豆甾醇和胆固醇等其他类似甾醇进行比较后发现，只有 7-DHC 和麦角甾醇具有很强的阻止磷脂自氧化和抑制铁死亡的活性（图 3f-h）。对远端胆固醇生物合成中的甾醇和 7-DHC 类似物的结构分析表明，只有 7-DHC 和麦角甾醇含有一个 5,7 二烯，它可能充当脂肪酯的 H 原子供体（图 3f），这表明 B 环中的共轭二烯对 7-DHC 抑制铁死亡非常重要。与此相一致，在远端胆固醇生物合成中与 7-DHC 具有相同环结构的另一种甾醇--7-脱氢去甲基甾醇也能强烈抑制铁死亡。此外，诱导铁死亡会显著降低 7-DHC 的水平，同时增加其氧化产物 DHCEO（图 3i），而 7-DHC 的氧化产物 DHCEO 则会增加。7-DHC 处理既不会影响铁变态相关基因的表达，包括 GPX4、FSP1、SLC7A11 和 ACSL4，也不会激活胆固醇稳态调节因子 SREBP2 及其下游基因，如 SCD1、ACSL1 或转铁蛋白（TF）。
由于膜磷脂中多不饱和脂肪酸尾部的氧化（而不是游离多不饱和脂肪酸的氧化）会导致铁变态反应，作者研究了 7-DHC 是否能抑制线粒体和质膜上的磷脂过氧化。作者的数据显示，线粒体和质膜上都能轻易检测到 7-DHC，在 DHCR7 缺乏后，线粒体和质膜上的 7-DHC 大量积累（图 3j,k）。意想不到的是，作者发现在质膜和线粒体上都能轻易检测到 DHCR7。先前的一项研究表明，DHCR7 Cys380 可被脂质过氧化过程中产生的脂质衍生亲电物羰基化。这促使作者研究 DHCR7 的活性是否在铁死亡过程中受到调控。作者证实 DHCR7 在铁死亡过程中确实以时间依赖性方式在 Cys380 处发生羰基化。值得注意的是，作者的体外试验表明，羰基化促进了 DHCR7 的酶活性。AlphaFold2 预测的人类 DHCR7 与来自 Methylomicrobium alcaliphilum 的 delta14-sterol 还原酶的晶体结构（蛋白质数据库（PDB）：4QUV）之间的结构比对显示，Cys380 位于 DHCR7 的 NADPH 结合口袋附近，这表明 Cys380 的修饰可能会影响 DHCR7 的 NADPH 结合亲和力以及催化活性。这些数据共同表明，7-DHC 的抗铁死亡作用可能在铁死亡的不同阶段受到动态调节，在铁死亡的早期阶段可能更有意义。
实验结果4
7-DHC 调节肿瘤铁死亡
尽管越来越多的证据表明，以铁死亡为靶点可能是一种很有前景的癌症治疗策略，但不同恶性肿瘤对铁死亡的易感性大不相同。因此，作者使用 TASIN-30 -- 一种针对 7-DHC 合成上游酶 EBP43 的选择性抑制剂，研究了是否可以利用药理学阻断 7-DHC 合成来治疗癌症。作者证实，用 TASIN-30 处理可显著降低癌细胞中的 7-DHC 水平（图 4a）。此外，TASIN-30 处理明显增加了各种癌细胞对铁死亡的敏感性（图 4b）。使用 EBP- 和 DHCR7-KO 细胞证实了 TASIN-30 通过靶向 7-DHC 合成对铁死亡的影响。作者还评估了阻断 7-DHC 合成是否会引发癌细胞的铁死亡。由于 7-DHC 由 SC5D 合成，但被 DHCR7 消耗，作者通过分析 Project Score 数据库 (https://score.depmap.sanger.ac.uk/) 寻找体能可能依赖于 7-DHC 的细胞系，发现 42 个癌细胞系的体能在很大程度上依赖于 SC5D，但不依赖于 DHCR7（图 4c）。其中，SU-DHL-8 被确定为得分最高的细胞系（图 4c），表明 7-DHC 在其适应性中起着至关重要的作用。值得注意的是，作者证实 SU-DHL-8 细胞含有大量 7-DHC（约 110 纳克/百万细胞）（图 4f）。重要的是，即使在没有其他铁死亡诱导剂的情况下，仅用 TASIN-30 阻断 7-DHC 的生物合成也会明显引发 SU-DHL-8 细胞的铁死亡，这表明内源性 7-DHC 对保护 SU-DHL-8 细胞免受铁死亡的影响至关重要（图 4d-f）。这些数据共同表明了 7-DHC 在多种癌症类型中抗铁死亡的重要性。特别是，作者证明了 7-DHC 是某些类型癌细胞存活的必要前提。
接下来，作者利用一种临床前肿瘤动物模型，评估了 7-DHC 的抗铁锈作用是否会成为一种治疗弱点。为此，作者研究了 TASIN-30 对小鼠异种移植 SU-DHL-8 肿瘤生长的影响。数据显示，注射 TASIN-30 不仅能显著降低肿瘤组织中的 7-DHC 水平，还能抑制肿瘤生长（图 4g），且对小鼠体重无明显影响。同时注射脂氧司他丁-1可取消TASIN-30诱导的肿瘤抑制作用，这表明TASIN-30以依赖铁死亡的方式抑制肿瘤生长。通过检测脂质过氧化的产物--4-羟基壬烯醛（4-HNE）进一步证实了 TASIN-30 诱导肿瘤铁死亡的作用，4-羟基壬烯醛通常被用作铁死亡的替代标志物（图 4h）。这些数据共同表明，药理阻碍 7-DHC 的生物合成可能是治疗癌症（尤其是 7-DHC 水平较高的癌症）的一种有效唤醒铁死亡的策略。
最近的研究表明，血液中的黑色素瘤细胞会产生过多的氧化应激，使转移的黑色素瘤细胞更容易受到铁氧化作用的影响。因此，作者通过研究 7-DHC 对 B16F10 黑色素瘤细胞转移能力的影响，考察了 7-DHC 是否能保护癌细胞免受血液中氧化应激的影响，B16F10 黑色素瘤细胞含有低浓度的 7-DHC（每百万细胞约 5-10 纳克）。作者的数据显示，用 7-DHC 进行预处理可提高 7-DHC 的水平（达到每百万细胞 70 纳克左右），并显著保护 B16F10 细胞免于铁死亡。重要的是，7-DHC 处理促进了 B16F10 的肺转移。同样，Dhcr7 基因缺失会减弱 RSL3 诱导的铁死亡，并在不影响肿瘤生长的情况下显著增加转移。请注意，TASIN-30 预处理可有效促进 Dhcr7 缺失细胞中 B16F10 的铁死亡并阻止其转移，这表明 7-DHC 的内源浓度可能是决定 TASIN-30 在体内和体外敏感性的关键检查点。向小鼠直接注射 AY9944 并不能促进转移，这表明癌细胞中的高水平 7-DHC 而不是宿主体内的高水平 7-DHC 能增强黑色素瘤克服体内氧化应激的能力，并加剧肺部的转移播种。在现阶段，作者不能排除 7-DHC 除了抑制铁死亡外，还可能通过更复杂的机制促进转移的可能性。
实验结果5
7-DHC 保护肾脏免受 IRI 的伤害
铁死亡被认为是 IRI 中细胞死亡的主要形式。因此，作者研究了提高体内 7-DHC 水平是否能保护肾脏免受 IRI 的影响。由于直接注射 7-DHC 在体内并不适用，作者选择通过靶向 7-DHC 催化酶 DHCR7 来提高内源性 7-DHC 的水平（图 5a）。作者的数据显示，预先注射 AY9944 能显著提高小鼠肾脏和血清中 7-DHC 的水平（图 5b）。重要的是，根据血尿素氮和血清肌酐的评估，预先注射 AY9944 能够保护肾脏免受 IRI 的影响（图 5c、d）。组织病理学分析进一步证实了这种保护作用（图 5e、f）。一致的是，预先注射 AY9944 能显著减少铁死亡，这体现在 4-HNE 水平的降低（图 5g,h）。此外，使用另一种 DHCR7 抑制剂卡哌嗪也能检测到类似的保护效果。综上所述，这些结果表明，内源性 7-DHC 的积累可抑制体内铁死亡，而靶向 DHCR7 可能是治疗 IRI 的一种有前景的方法。
