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BRD9（含溴结构域蛋白9）是一种参与癌症和炎症性疾病的关键表观遗传因子，但由于现有靶向药物选择性差和表型活性差，使其成为一种难以成药的靶标。PROTAC提供了一种克服这一问题的替代策略。2024年6月24日，浙江大学车金鑫研究员、上海药物研究所周宇波研究员和浙江大学董晓武教授团队在JMC上发表了题为“Discovery of a Highly Potent and Selective BRD9 PROTAC Degrader Based on E3 Binder Investigation for the Treatment of Hematological Tumors”的文章。在本研究中，作者探讨了不同E3连接酶配体对BRD9 PROTAC降解的贡献。通过分子对接、结合亲和力分析和构效关系研究，确定了一种高效PROTAC E5，具有出色的BRD9降解能力（DC50 = 16 pM）和MV4-11细胞（IC50 =
0.27 nM）及OCI-LY10细胞（IC50 = 1.04 nM）的抗增殖活性。E5能够选择性地降解BRD9并诱导细胞周期停滞和凋亡。此外，在异种移植肿瘤模型中，E5的治疗效果得到了确认，并伴随进一步的RNA测序分析。因此，这些结果可能为高效PROTAC降解剂的发现和研究提供参考。
BRD9作为表观遗传调控因子发挥着重要作用，但之前被认为是难以成药的靶标。作为哺乳动物SWI/SNF染色质重塑复合物中nc-BAF/GBAF的特定亚基，BRD9在疾病调控中的作用已有详细报道，特别是其在肿瘤发展和自身免疫性疾病中的作用。最近的研究强调了BRD9在急性髓性白血病（AML）中的重要性，BRD9常常被发现过度表达。通过生物或化学方法靶向或下调BRD9在阻碍AML进展方面有良好的效果。然而，BRD7和BRD9之间的选择性以及表型作用较弱阻碍了BRD9抑制剂进入临床试验。所以，BRD9被认为是一种非典型的难以成药的蛋白质。PROTAC凭借其克服选择性和增强表型效应的独特优势，在克服开发BRD9抑制剂的挑战方面吸引了越来越多的关注。目前，已有两种BRD9 PROTAC进入临床阶段。CFT8634在I/II期临床试验中口服给药，BRD9降解的DC50值为3 nM。FHD-609由Foghorn Therapeutics开发用于滑膜肉瘤，其最高开发状态为临床I期。此外，还有其他靶向BRD9的PROTAC，如VZ-185，可降解BRD7和BRD9。dBRD9，一种选择性BRD9降解剂。这些分子表明，PROTACs有可能成为解决BRD9难以成药特性的一种有效方法。在PROTACs的设计和开发过程中，主要研究了连接子和POI配体的结构修饰。然而，研究表明，E3配体的修饰可能会大大增强PROTACs的活性。目前，BRD9 PROTACs中常用的E3连接酶包括CRBN和VHL。大多数降解剂基于CRBN配体（沙利度胺、泊马度胺或来那度胺），因为它们具有分子量小和合成方便的优点。对CRBN配体的修饰可以通过多种方式影响PROTAC的功效，包括增加与CRBN的亲和力、增强化学稳定性以及选择性地作用于IMiD（免疫调节药物）新底物。作者团队之前的研究揭示了由于CRBN配体的不同连接位置导致BRD9降解和细胞活性的显著活性差异。本文主要集中在CRBN配体的结构探索，通过计算机辅助和合理设计，成功设计并合成了高效的BRD9 PROTAC E5。化合物E5采用苯并咪唑结构作为E3配体，表现出显著的BRD9蛋白降解活性，DC50为0.016 nM，且具有很高的选择性，通过蛋白质组学分析未发现BRD4和BRD7的降解。 E5对急性髓性白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤等血液肿瘤表现出强大的抗增殖效果。此外，E5的良好治疗效果在异种移植模型中得到了验证。本研究有助于分析BRD9 PROTACs中E3配体的构效关系（SAR），扩展了BRD9降解剂的分子结构库，获得了高效化合物E5，并提出了利用PROTAC降解BRD9以克服其难以成药特性的可行性。基于CRBN配体的合理设计以及PROTACs的合成
在对文章和专利中 E3 结合体结构的调查中，作者团队收集了 70 种具有不同结构变化的 CRBN 配体。所有结构都显示出较好的亲和力或活性指数，是可以进行下一步开发 BRD9 PROTACs的候选结构。所选结构涵盖了广泛的修饰手段，包括戊二酰亚胺分子内的氨基取代和手性碳取代，以及各种开环反应（醚键、亚胺键或酰胺键）和去掉丁二酰亚胺基团。此外，作者还探索了苯环系统中芳香氢的去除、增强和替代等手段对亲和性的影响。 PROTAC 诱导的 POI 降解需要形成 POI-PROTAC-E3 三元复合物，进一步导致 POI 泛素化和降解。作者认为 CRBN 与配体之间的高亲和力结合可能有利于复合物的形成。作者团队使用计算对接技术将每种配体与蛋白质 CRBN（PDB ID：4CI3）对接，用 MM/GBSA 估算结合自由能并对配体与 CRBN 复合物的分子动力学轨迹进行了能量分解分析，利用这些得到的分数来评估配体与蛋白质之间的亲和力，并预测这些小分子的潜在活性。分析结果表明，与沙利度胺相比，大多数结构的得分相当或略高于沙利度胺；戊二酰亚胺结构中的开环可能会显著降低亲和力，而手性的丧失仅有轻微影响；相反，保留芳香环和丁二酰亚胺分子之间的酰胺键或亚胺连接可保持原有的亲和力。在CADD指导下作者团队挑选了 10 个结构（A1-A10）作为配体结构进行合成。在 A1-A10 结构上引入了一个或两个哌啶或哌嗪环系统，形成了系列 B 和系列 C 化合物。根据以往的合成经验和预测的亲和力得分，选用了前期工作中的 BRD9 弹头以及系列 B 和 C 中的 "E3 配体+连接体 "片段进行连接组装，将linker限定为一个或两个哌啶或哌嗪环，分别得到了化合物D1-10和化合物E1-5。![]()
图1 基于沙利度胺的CRBN配体及配体-连接体结构修饰
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图2 不同E3粘结剂BRD9 PROTACs的设计与优化策略
D/E系列化合物的活性评价
由于 BRD9 过表达在急性髓性白血病的发病过程中起着重要的驱动作用，作者选用 MV4-11 细胞系，通过WB实验评估其在 1、10 和 100 nM 浓度下的降解效果。其蛋白降解活性/细胞抑制活性与配体预测亲和性保持一致，化合物D10表现出最佳降解活性和抑制活性（1nM下降解率79.5%±7.8，IC50=35.27±1.03）。PROTAC 的有效性依赖于"POI-PROTAC-E3 连接酶 "三元复合物的形成，这种复合物的形成不仅取决于配体和蛋白质之间的高亲和力，还取决于连接体在溶剂暴露区的适当角度和长度。在对使用单环连接体的 D 系列进行研究时发现，某些化合物的降解活性并不令人满意。这可能是由于短linker形成主要三元复合物的可能性降低，进而影响了蛋白质降解的效率。为了验证上述假设并进一步提高 BRD9 PROTACs 的降解效率，作者重点研究了某些 CRBN 配体与加长linker相结合来优化降解效率的可能性。以往的经验表明，在连接体中加入刚性片段可以提高药效和药代动力学活性。基于这一目标，设计了E1- E5。系列 E 中的所有化合物都显示出较好的降解活性， 10 nM 下BRD9 的降解水平大于等于 85%。与 D1-D3 相比，E1 的降解活性最佳（D1-D3 的 CRBN 配体都是通过酰胺键连接的）此外，采用单环连接的 D8 只显示出中等程度的活性（100 nM 时为 80.5%），通过延长linker，E2 在中高浓度下几乎能完全降解 BRD9（尽管其在 1 nM 时降解能力一般）。在比较 E2 和 E3 时发现，E3 在低浓度下的降解活性有所提高，在 10 或 100 nM 时的降解水平相似。通过对降解结果的分析，作者发现在不同的 E3 结构中设计特定的链长可以显著提高活性。这进一步证明了 E3 配体和连接体的结构对 PROTAC 的降解活性同样重要。通过适当设计linker，可以提升活性较差的分子对 BRD9 的有效降解。E 系列在细胞活性方面表现出非常令人满意的结果。其中活性最好的化合物 E5 IC50值为 0.27 ± 0.02 nM。总之，这一系列研究证明了 BRD9 降解与肿瘤细胞杀伤力之间的相关性。在该系列中，除 E2 外，所有分子的活性都优于目前临床上可用的 BRD9 降解剂。经工具细胞证实，E 系列的强效细胞活性是通过 CRBN 诱导的 BRD9 降解介导的，且不同的 CRBN 配体需要不同长度的连接体才能发挥药理作用。![]()
图3 D1-10的活性评价
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图4 E1-5的活性评价
化合物E5的降解机理和降解动力学
通过三元复合物模拟，从分子角度解释了 E5 的高效降解和细胞活性，并全面分析了其理化特性。 E5与BRD9之间保持着关键的相互作用，如喹啉酮环与TYR106之间的Pi-Pi堆积相互作用、该环上的羰基与ASN100之间的关键氢键相互作用以及苯与PHE44之间的T堆积相互作用。此外，与沙利度胺不同的是，E5 中经过修饰和重新设计的 CRBN 配体不仅与 PRO354、HIS380 和 TRP382 形成了固有的氢键，还与苯并咪唑有额外的 Pi-Pi 堆叠相互作用。此外，E5 的扩环系统填充了 CRBN 的蛋白结合口袋，使三元复合物的构象更加稳定。因此，作者认为E5与其他分子的巨大活性差异是源于其苯并吲哚的新结构，其与原始结构相比产生了更紧密的相互作用。这些固有的和额外的 Pi-Pi 相互作用以及额外的苯环相互作用提供了更强大的空腔占据。在 MV4-11 细胞中对 E5 的降解动力学进行了评估，结果显示其降解趋势与剂量相关，能高效降解 BRD9 蛋白。 E5 的最大降解量（Dmax）接近检测定量的极限（Dmax = 97%），E5 的 DC50为 0.016 ± 0.016 nM。此外，E5 还能在 2 小时内显著降低蛋白质水平，处理 4 小时后，BRD9 降解率达到 92%。总之，E5 能以剂量和时间依赖的方式高效、快速地降解 BRD9 蛋白。![]()
图5 E5三元复合物的预测结合模式
E5的降解机制和选择性研究
为了评估泛素-蛋白酶体系统的参与情况，用蛋白酶体抑制剂MG132和激活NEDD8抑制剂MLN4924对MV4-11细胞进行了预处理。研究结果表明，BRD9的降解明显受阻，这表明E5是通过泛素-蛋白酶体系统发挥作用的。此外，BRD9抑制剂I-BRD9和CRBN配体泊马度胺的预处理可抑制E5诱导的BRD9蛋白降解。这表明泊马度胺和 I-BRD9 可竞争性地抑制 CRBN 和 BRD9，从而阻止与 PROTAC 形成三元复合物，抑制 BRD9 蛋白降解。初步研究表明，CRBN 诱导的 PROTACs 有可能保留降解锌指家族蛋白的药理特性。 PROTACs的设计主要侧重于 CRBN 配体的结构修饰，以选择性地降解 GSPT1 等关键蛋白。实验结果表明，E5 对新底物招募具有极佳的选择性，不会降解 GSPT1。本研究中使用的 BRD9 弹头在靶向 BRD7 和 BRD9 中均有活性，这两个蛋白的溴结构域高度同源。在 0.1、1、10 和 100 nM 的浓度下对 E5和BRD4/BRD7 进行了选择性研究。结果表明，即使在 100 nM 的浓度下，化合物 E5 也不会诱导 MV4-11 细胞中 BRD4 和 BRD7 的降解。然而，在 1 nM 的浓度下，E5 能显著降解 BRD9 蛋白，这表明它只具有降解 BRD9 蛋白的选择性能力。蛋白质组学共检测了 4849 个蛋白质。定量蛋白质组学实验显示，包括 BET 家族蛋白在内的同源Brominedomain 蛋白并未受到显著影响，Western Blot 的结果也与此类似。![]()
图6 E5的降解选择性
E5对多种血液恶性细胞系、PBMC和HEK293T细胞生长抑制作用的评价
为了评估E5在血液恶性肿瘤细胞中的抑制作用，选用MOLM13（人类急性髓性白血病细胞）和Kasumi-1（急性髓性白血病细胞）在内的多种白血病细胞系进行实验，用BRD9 降解剂 (±)
CFT8634 和选择性 BRD9 抑制剂 I-BRD9 作为阳性对照。化合物 E5 在 MOLM13 细胞中也表现出优秀的抗增殖活性，IC 50值为 0.34 ±
0.14 nM。与 MV4-11 细胞相比，(±)
CFT8634 在 MOLM13 细胞中的活性大大低于 E5。此外，在 Kasumi-1 细胞中，E5 的 IC 50值为 1.13 ± 0.30 nM。这些结果表明，E5 在其他一些 AML 细胞系中也表现出良好的抗增殖活性。E5 的体内药代动力学和药效学研究
E5在小鼠灌胃给药时，在20 毫克/千克的剂量下C max值为 126.98 ng/ml，AUC 0-t值为 1297.06 h•ng/ml。在综合评估体外活性和药代动力学数据的基础上，作者选择 E5 研究其对裸鼠皮下移植 MV4-11 细胞和 Balb/c 小鼠 OCI-LY10 细胞生长的抑制作用。在 MV4-11 异种移植小鼠模型中，E5 通过腹腔注射给药。在给药期间，没有观察到任何小鼠出现明显的体重下降或行为异常（图 S7A）。与对照组相比，治疗组肿瘤组织中的 BRD9 蛋白完全降解。同样，E5在OCI-LY10异种移植小鼠中也发挥了良好的肿瘤抑制效果，且对小鼠没有明显毒副作用。![]()
图7 E5在异种移植模型中的抑制作用
结论
在这项研究中，PROTAC 被用作克服 BRD9 不可药用性的一种策略。通过对 CRBN 配体的计算化学和 SAR 分析，作者成功开发出了一种高效力、高选择性的 BRD9 降解剂 E5。 E5 通过泛素蛋白酶体系统以时间和剂量依赖性的方式高效、选择性地降解了 BRD9。此外，E5 还能诱导 MV4-11 细胞凋亡并阻滞细胞周期。基于两种药理动物模型，证实 E5 不仅在体外表现出强大的增殖抑制活性，而且对 MV4-11 和 OCI-LY10 异种移植肿瘤也表现出高效的抑制活性。这项研究不仅为通过修改和分析 CRBN 的配体来优化 PROTAC 提供了宝贵的见解，还证明了 PROTAC 在克服不可药靶点方面的有效性和可行性。这也强调了降解 BRD9 在治疗 AML 和 DLBCL 肿瘤中的潜在应用。原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c00883
