JMC | SARS-CoV‑2 主蛋白酶PROTAC
文摘
2024-04-19 03:13
荷兰
论文题目：Discovery of First-in-Class PROTAC Degraders of SARS-CoV‑2 Main Protease通讯作者：美国Texas A&M University生物系的Benjamin W. Neuman，药学院的Wenshe Ray Liu和化学系的Shiqing XuSARS-CoV-2的基因组编码保守的复制酶、结构蛋白以及可编码附属蛋白(accessory protein)的众多开放阅读框架(open reading frame,
ORF)。ORF1ab是最大的ORF，可编码多聚蛋白pp1ab和pp1a。这些多聚蛋白可断裂形成16个非结构蛋白(nonstructural protein, nsp)，而介导蛋白断裂的酶为nsp3(PLPro, 木瓜样蛋白酶)和nsp5(3CLPro, MPro,主蛋白酶)。MPro可切下13个nsp，且在不同冠状病毒中较为保守。MPro是半胱氨酸蛋白酶，具有三个结构域，其活性形式为同源二聚体。蛋白中的Cys145-His41起催化作用。最初的抗病毒药物设计目的为寻求可结合MPro的高亲和力分子，进而限制酶活性与功能。如辉瑞开发的可口服的可逆共价MPro抑制剂nirmatrelvir。其与ritonavir连用后的Paxlovid被FDA批准用于治疗COVID-19。Paxlovid存在副作用和药物药物相互作用，且对于MPro突变株存在耐药。有必要开发存在新机制的抗病毒疗法。- 可灵活利用不同结合位点，且不需要持久结合。因此对于不可成药靶点，可因需求来利用其变构位点。
- 通过靶蛋白与E3酶间的蛋白蛋白相互作用提高靶点选择性
主蛋白酶的共价抑制剂主要依赖于Cys145。本文作者基于前期开发的抑制剂设计合成了可逆共价结合抑制剂MPI8。同样基于Boceprevir，设计合成了MPI29(酶水平IC50 = 9.3 nM)。PROTAC中引入共价可逆抑制剂可在提高降解活性、选择性和减少耐药的同时，降低不可逆共价抑制剂因脱靶造成的毒性。作者最后选择MPI8和MPI29。在MPI8的共晶结构中，苯基在口袋中的结合并不确定(图中的电子密度不完全)；MPI29的共晶结构中分子的叔丁基可作为合适的位点，引入linker。选用CRBN配体泊马度胺和4位羟基取代的沙利度胺。MPD1-MPD6基于MPI8，MPD7-MPD9基于MPI29。其中MPD5-MPD6采用三氮唑作为linker。将MPD1-MPD10进行Mpro抑制活性评价(孵育30min)，结果表明均具有抑制活性，PROTAC分子并不会干扰小分子与蛋白的结合。通过将Mpro与eGFP融合，作者构建了可表达Mpro的293T细胞体系。天然的Mpro需要切断其C末端及N末端，最终保留自由的N端残基用于后续激活。本例中，为了确保蛋白活性，N端引入MAVLQ自断裂标签，同时C端Q306突变为G，以避免eGFP被切除。Mpro-eGFP的不同表达水平并未对细胞产生明显毒性。作者后续采用WB实验检测其DC50(半数最大降解浓度)，结果表明MPD1-3降解活性最好(419、296和431 nM)，其对293T细胞的CC50分别为25、120和21 μM。MPD2的毒性最小且降解活性最好，因此选择MPD2进行后续研究。MDP2可长时间发挥作用。肝微粒体稳定性测定表明其半衰期为48 min，清除率为36.2 mL/min/kg。作者采用竞争性实验以探究其机制。MPI8的加入可降低MDP2的降解效果。泊马度胺的加入也可降低其降解活性。因此MDP2发挥作用需要结合Mpro和CRBN。随后采用CRISPR技术敲除CRBN，发现MDP2降解活性下降。蛋白酶体抑制剂MG132同样可以降低MDP2的降解活性。作者在ACE2+的A549细胞内，评价了其抗SARS-CoV-2的Delta突变株hCoV-19/USA/HP05647/2021的活性。不同浓度MDP1-3孵育72h，随后使用PT-PCR检测病毒mRNA水平以确定EC50。其值分别为1780、492和1160 nM随后作者利用单抗探究了Mpro蛋白在细胞内的积累情况，最终发现MDP2活性最好。在其他SARS-CoV-2变体WA.1、BA.1和XBB.1.5中，2.5 μM的MDP2可抑制病毒复制。对于Mpro E166A突变株(nirmatrelvir对其活性下降10倍)，将该病毒工程化引入BSL-2 SARS-CoV-2 Δ3678 mGFP后(开发用于临床新冠血清学检测的平台)，相较野生型Δ3678 mGFP，MDP2对其活性提高5倍。作为proof-of-concept研究，本研究表明了使用PROTAC分子来降解Mpro的可行性，且可用于治疗新冠突变株。
