分子胶 (Molecular glues，MG) 是单价小分子，通过将蛋白质-蛋白质相互作用 (protein–protein interaction，PPI) 界面改变为更高亲和力状态来诱导蛋白质（天然或非天然E3底物）之间的相互作用。增强蛋白质和 E3 泛素连接酶之间的 PPI 可能导致配对蛋白质降解。在过去的十年中，临床药物的回顾性研究发现，免疫调节药物（例如沙利度胺（thalidomide）及其类似物）和indisulam分别通过驱动非天然底物与CRBN和DCAF15连接酶之间的相互作用而表现出分子胶效应。随后针对 MG 发现的表型筛选报告表明，这些分子可能比最初预期的更为常见。然而，MG 的前瞻性发现仍然具有挑战性， MG 的发现是一个完全由偶然性驱动的过程，并且不存在合理的发现策略。因此，扩大分子胶的范围将增强我们对未来设计原则的理解。
在此回溯了基于DCAF16泛素连接酶的靶向BRD4共价分子胶的最新进展及机制。
1. BRD4的选择性抑制剂JQ1
BRD4，溴结构域蛋白 4，是溴结构域和 c 末端结构域外 (BET) 蛋白家族的成员。该家族由 BRD2、BRD3、BRD4 和 BRDT 组成，所有这些都与组蛋白尾部和其他蛋白质上的乙酰化赖氨酸残基结合。乙酰化赖氨酸作为表观遗传标记，一旦与 BET 家族蛋白结合，就会导致 RNA 聚合酶和其他转录相关蛋白募集到这些位点，从而调节转录起始和延伸。BRD4 作为肿瘤学靶点 因为它通常是血液肿瘤中癌基因（包括 Myc）表达所必需的。Bromodomains(溴结构域)是这些蛋白质中与乙酰化赖氨酸相互作用的结构元件。BRD4 包含两个溴结构域，溴结构域 1 和溴结构域 2。这两个溴结构域高度同源，结构彼此非常相似，并且与其他 BET 家族成员中的溴结构域非常相似。多款BRD4的选择性抑制剂正在临床试验中。
JQ1是BRD4的选择性抑制剂，于2010年首次发表(Nature 468, 1067–1073 (2010). 10.1038/nature09504)。JQ1具有细胞渗透性，它竞争性地结合乙酰基赖氨酸识别基序或溴结构域。对人类溴结构域蛋白家族具有高效力和特异性。通过JQ1与BET家族成员 BRD4 的共晶结构，揭示了JQ1与乙酰赖氨酸结合口袋的良好形状互补。
2. 基于JQ1的PROTAC分子
除了作为抑制剂，JQ1还在多篇研究中作为靶标蛋白的配体设计的PROTAC分子。如2015年science发表了以JQ1作为配体设计而成的PROTAC分子dBET1（Science. 2015 Jun 19; 348(6241): 1376–1381. 10.1126/science.aab1433）。dBET1 是一种由 Cereblon 和 BRD4 配体连接的 PROTAC，EC50为 430 nM。由通过连接子将竞争性 BET-溴结构域拮抗剂与 IMiD 样邻苯二甲酰亚胺部分缀合，得到异双功能化合物。在细胞系和小鼠异种移植物实验中，dBET1 诱导 BET 蛋白中BRD2、BRD3 和 BRD4 快速、有效和选择性降解，并且在AML 异种移植模型中，连续降解剂治疗优于竞争性BET抑制剂。该工作促成了知名PROTAC药企 C4 Therapeutics 的成立。
3. 基于JQ1反式修饰的共价分子胶
常见的顺式反式作用，以基因转录为例，转录因子即是反式因子，而基因组上的启动子等元件即是顺式作用元件。这里涉及的反式作用，相当于A分子的抑制剂反向作用于B分子。
3.1 基因泰克的单价降解剂化合物1a
更有意思的是，后续有基因泰克公司专利报道了，化合物1a是由经典的BET抑制剂(+)-JQ1组成，它带有炔丙基胺尾部，并被意外地发现具有单价降解剂的功能（WO2020055976, 2020.）
3.2 AbbVie筛选确认JQ1 的单价降解剂的泛素连接酶为DCAF16
2023年初AbbVie公司报告了在使用基于 JQ1 的单价降解剂化合物1a（monovalent degrader）的 BRD4 降解测定中对 1000 多种连接酶和泛素蛋白酶体系统组件进行 CRISPR/Cas9 敲除筛选的结果（ACS Chem. Biol. 2023, 18, 331−339，10.1021/acschembio.2c00747）。确定了 Cul4连接酶复合物的底物识别成分 DCAF16 对于化合物活性至关重要，并且证明化合物1a驱动 DCAF16 和 BRD2/4 之间的相互作用，从而促进靶标降解。化合物1a作为 BRD2/4 和 DCAF16之间的 MG 降解剂发挥作用，并为进一步的机制剖析以推进前瞻性MG 发现奠定了基础。
首先确定单价化合物在细胞内的类分子胶的降解效果。基于JQ1的单价化合物以蛋白酶体依赖性方式选择性降解BET蛋白。(A)先前报道的化合物1a和7a的结构。(B)在细胞HiBiT降解试验中，剂量依赖性BRD4降解;化合物在HEK293 BRD4-HiBiT细胞中孵育6或16小时。(C)与7a相比，化合物1a的全蛋白质组降解谱。HCT-116细胞被DMSO, 10 μM化合物1a或10 μM 7a处理6小时。样品被处理用于TMT-MS分析。
然后确定HiBiT筛选系统的可靠性。化合物1a以蛋白酶体和cullin-RING连接酶依赖的方式降解BRD4。在蛋白酶体抑制剂bortezomib（硼替佐米，BTZ) (1 μM)和类泛素化（neddylation）抑制剂MLN4924 (1 μM)存在下，BRD4-HiBiT降解。将化合物置于HEK293 BRD4-HiBiT细胞中孵育6 h。
CRISPR/ Cas9介导的连接酶敲除筛选鉴定降解的筛选流程及结构。(A)使用阵列方法在HEK293 BRD4-HiBiT细胞中进行CRISPR/Cas9敲除的全USP筛选流程。Cas9和sgRNA RNPs在384孔板中核转染细胞5天，然后进行细胞降解HiBiT试验。每个孔包含指向不同基因的多导sgRNA(三个序列);共筛选出1158个基因。在HiBiT实验中，使用DC80单次剂量的降解剂处理细胞16小时，然后将敲除孔的降解与scrambled sgRNA处理的孔的降解进行比较。(B)用300 nM 1a处理细胞过夜，通过HiBiT检测BRD4的表达。挽救百分比为(SignalKO+degrader − SignalWT+dBET6)/(SignalWT+vehicle − SignalWT+dBET6) × 100，其中信号为BRD4-HiBiT信号，KO为Cas9+连接酶sgRNA, WT为Cas9+非靶向sgRNA, vehicle为DMSO。(C) Cul4A - DCAF16连接酶复合物和类泛素化成分。在依赖性筛选中确定了蓝色的基因。(D-E) HEK293 BRD4-HiBiT细胞中，以DCAF16 遗传敲除和回补，验证化合物1a的降解活性依赖于DCAF16。
接下来确定化合物1a与BRD4结合模式。化合物1a转化为BRD4的BD1的分子模型。(A) 1a及其结合位点，基于BRD4的BD1 (PDB 3MXF37)中parent (+)-JQ1的晶体结构。(B) BD1结合口袋1a模型的扩展图，显示氨甲基炔丙基与蛋白表面的D145起关键作用。
化合物1a具有传统MG降解剂的特性。(A) IP-MS鉴定了化合物1a诱导的蛋白-蛋白相互作用。BRD4-GFP HEK293细胞用化合物1a或阴性对照加BTZ（蛋白酶体抑制剂)处理4 h后进行免疫共沉淀。(B) BRD4-HiBiT细胞在高浓度降解剂(可达30 μM持续6 h)下降解，观察到“钩状效应”。
3.3 反式标记共价分子胶机制
上文发表于January 19, 2023，后续另有实验室的Preprint文献(posted February 15, 2023.)对其机制进行了进一步的探索。如前所述，发现和开发新靶点的分子胶仍然具有挑战性。作者认为共价策略原则上可以通过稳定新蛋白界面来促进分子胶的发现。作者提出了反式标记共价分子胶机制（trans-labeling covalent molecular glue mechanism）的结构和机制研究，称之为“模板辅助共价修饰(template-assisted covalent modification)”。然后发现了一系列新的BRD4分子胶降解剂通过招募CUL4 DCAF16连接酶到BRD4（BRD4-BD2）第二个溴域而起作用。BRD4-BD2与DCAF16的复合物作为结构模板，促进DCAF16的共价修饰，稳定BRD4降解物-DCAF16三元配合物的形成，促进BRD4的降解。DCAF16共价修饰是BRD4分子胶降解剂活性的基础(10.1101/2023.02.14.528208)。
通过合成一系列GNE11（前述1a）结构类似物，发现了丙烯醛类似物TMX1，它对BRD4表现出更强的降解，同时对BRD4-BD2保持选择性（Dmax/16h~80%）。同样的，通过蛋白定量质谱和CRISP/Cas9筛选，发现了GNE11与DCAF16结合，促进靶标降解。
单价降解剂共价招募DCAF16到BRD4BD2及优化亲电性弹头。 a.随着TMX1浓度的增加，DDB1-DCAF16-BODIPY到BRD4BD1-铽或BRD4BD42-544铽的TR-FRET信号。 b.DDB1-DCAF16，DDB1-DCAF16与TMX1在4°C共孵育16 h，或DDB1-DCAF16与TMX1和BRD4BD2在4°C共孵育16 h的完整蛋白质谱。c, MMH1、MMH2、MMH1-NR、MMH2-NR的化学结构。 d. BRD4降解K562细胞处理DMSO, MMH1，MMH2, dBET6，或MZ16h。e. JQ1，MMH1，MMH2，MMH1-NR和MMH2-NR随增加浓度的TR-FRET信号（DDB1-DCAF16-BODIPY 和BRD4BD2-terbium）。 f.用DMSO，MMH1、MMMH2或MMH2-NR处理16 h后，K562细胞中BRD4降解的水平。
BRD4BD2将MMH2用于DCAF16修饰。 a-b. DDB1∆B-DDA1-DCAF16-BRD4BD2-MMH2的低温电子显微镜图，彩色显示DDB1BPA（红色）、DDB1BPC（橙色）、DDB1CTD（灰色）、DDA1（黄色）、DCAF16CTD（蓝色）、NTD（绿色）、DCAF16HLH（青色）和BRD4BD2（洋红色）。c. DCAF16的卡通表示，二级结构及Cys58。 d. MMH2共价修饰DCAF16 的Cys58的特写，在MMH2周围的低温电子显微镜密度显示为网格。
低温电子显微镜结构表明，DCAF16和BRD4BD2具有预先存在的结构互补性，可以最佳地定位降解剂的反应部分进DCAF16 Cys58共价修饰。对DCAF16和BRD4BD2的系统诱变表明，BRD4His周围的环状构象，而不是特定的侧链，是与DCAF16和BD2选择性稳定相互作用的关键。我们的工作共同建立了“模板辅助共价修饰”作为共价分子胶的机制，这为接近驱动药理学开辟了新的道路。
共价BRD4分子胶降解剂的作用机制示意模型。
此外，一篇文献已有报道(Preprint. 2023 Oct 10)。DCAF16 反式标记共价胶对 BRD4 降解的可调性探索。
A) BRD4抑制剂JQ1及其相关类似物GNE011的化学结构。 B) 研究各种半胱氨酸反应性亲电反应柄。 C)共价反式标记（covalent trans-labelling）事件的示意图及其与我们之前研究的相关性，显示共价反式标记 DCAF16 导致 BRD4 降解。
接下来对 JQ1 降解尾部修饰的分子胶进行SAR分析。
A) BRD4BD2-eGFP 和 mCherry 报告基因测定的示意图，以及 B) BRD4 降解剂背景下的 AlphaScreen 测定。 C) 通过 BRD4BD2-eGFP 和 mCherry 报告基因测定确定共价 JQ1 类似物对 BRD4BD2 的剂量依赖性降解。 D) 通过 AlphaScreen 测定确定共价 JQ1 类似物对 BRD4BD2 的剂量依赖性抑制。 E) 共价 SAR 中包含的共价 JQ1 降解尾部的化学结构。
总体上，分子胶已突破了传统上的认知，由于其优越的类药性质，将在药物发现中发挥越来越重要的重要，期待未来可以基于知识地设计分子胶分子。
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