1.背景
治疗性蛋白的生产利用未经修改或基因修饰的生物实体，包括细菌、哺乳动物细胞、病毒和酵母，来生产大型蛋白质分子。有些生产系统非常简单，例如生产天然产物如青霉素，因此不包括在本章中。为了清晰理解治疗性蛋白的生产过程，重要的是要了解DNA和RNA在我们身体中的作用。生产过程在上游和下游处理的每个操作单元中紧密相连。产量的变化、不同的杂质和蛋白质产品的效力是显著影响生产过程中所涉及步骤的因素。因此，生产过程应该仔细规划在漫长的定义和发展过程中，以流程图的形式确定尺寸问题。生产过程始于通过培养建立基因修饰的细胞系，以在生物反应器中表达所需的治疗性蛋白。术语“生物反应器”指的是支持生物实体生长的设备或容器，术语“发酵罐”也指的是涉及气体和热量产生的生物反应容器；在许多情况下，这些术语可以互换使用。用于生产治疗性蛋白的正确术语是生物反应器。第一步，允许生物实体表达所需的治疗性蛋白（产品），接下来，通过过滤（如果治疗性蛋白处于溶液中）或首先破坏细胞（在细菌的情况下）然后通过多步骤过程去除蛋白质，从培养基中移除表达的蛋白产品。随后的步骤包括治疗性蛋白的纯化，在某些情况下，还包括诱导正确的蛋白质折叠。如果使用易受病毒感染的哺乳动物细胞作为表达实体，那么应该去除任何病毒污染。最后，纯化的治疗性蛋白在用缓冲液稀释并储存在-20°C时，应标记为药物物质。生产后，药物物质应配制成药物产品，形式可以是瓶装溶液、预充填注射器或冻干粉末。迄今为止，治疗性蛋白是通过注射给药，但正在努力使这些蛋白将来可以通过口服、经皮、吸入或其他途径给药。治疗性蛋白的生产过程昂贵且受到严格的监管控制，因为分子结构的微小变化都可能改变它们的免疫原性和效力。最新的单次使用、连续生产（CM）和在线监测技术正在迅速改变生产风险概况。它们在规划生产设施方面提供了许多长期优势，本章将详细描述。
2.工艺优化
2.1.细胞系开发
传统细胞系的开发耗时较长。从概念到创建高产和高质量的克隆，早期阶段的生产可能需要近40周的时间。这包括选择合适的细胞系、构建表达载体、转染细胞、细胞筛选、克隆选择以及基于细胞生长和生产力的评估。从监管的角度来看，单细胞分离和筛选是细胞系开发工作流程中的关键步骤。传统的筛选方法涉及在96孔板中每个孔播种一个单细胞，然后筛选多个板以选择高产者。今天可用的几种工具可以加速细胞系开发中涉及的一些步骤，并且可以帮助缩短总体时间线。细胞系开发者可以使用有效的靶向转染过程，允许基因插入到与之前使用的随机转染事件相比的“热点”。这种特定的操作允许创建高产细胞系，并显著减少了后续筛选过程。此外，与传统过程相比，不是筛选多个板（50-100个板），每个孔包含一个克隆，而是将细胞播种到小池中，然后选择表现出色的细胞池，从而获得更小的细胞群体，从而有助于选择最终的单个克隆。荧光激活细胞分选与谷氨酰胺合成酶结合是一种快速克隆筛选方法。今天，基于微流体学的技术开发被细胞系开发者广泛使用。这些系统可以分选和沉积单细胞，也可以在很短的时间内（少至5天）提供克隆性、增殖率和特定生产力的证据。当作为组合技术使用时，它们可以显著缩短细胞系开发的总体时间线，几乎减少到8-10周，从而帮助过程开发更快地向早期交付成果迈进。一些制造商继续专注于传统技术，如在半固体介质中平板化和确定个体克隆的蛋白质滴度在静态阶段，这与连续培养阶段并不相关。最常用的富集方法可能包括高产者，但也包括预筛选，包括荧光激活细胞分选或载体优化以进行筛选。与生物工艺技术相关的一个神话是，必须迫使细胞系产生更高的产量。然而，在细胞系变得不稳定之前，推动细胞系的程度是有限的；细胞将产生更高的滴度，这可能对单克隆抗体并不理想，但对于单克隆抗体来说，糖基化的变化和其他DNA变化将变得不可避免。因此，开发者必须根据作为碳源的培养基成本计算总成本，这些培养基是用于中试生产所需的，然后再转向高产细胞系。在许多情况下，高产细胞系有助于减小生物反应器的尺寸，但并不一定降低货物成本。
2.2.细胞培养基
细胞培养基是细胞培养的主要原料，存在100多种不同的配方，包括氨基酸、维生素、脂肪酸和脂质等关键成分。培养基的化学成分、配方和浓度是决定培养基是否适合支持细胞生长、细胞代谢、产量和蛋白质质量的关键因素。细胞培养基的发展显著影响细胞密度，增加特定生产力，并提高产品质量（减少变异性）。以下部分介绍了一些可以增强过程强化的培养基优化策略和挑战。培养基优化方法不能普遍适用于所有细胞系或克隆；可能提高一个克隆生产力的培养基不一定能提高另一个克隆的生产力。同样，产品质量也会受到影响。特别是使用单一基础培养基的平台方法，总是不太可能产生满意的结果。虽然使用现有的培养基（易于获取培养基成分并具有固定和验证的方法）对于使用相同宿主细胞系生产所有单克隆抗体产品是有利的，但产品质量的变化（糖基化、电荷变体等）可能是最终产品功能所必需的。因此，即使只有有限数量的化合物，也强烈推荐具有独特的解决方案。传统的方法开发培养基并评估其适用性涉及一次改变培养基中的一个成分。实验设计方法可以研究成分之间的关系以优化组成。根据培养基中使用的成分数量，可以进行多次迭代，这使得评估相对耗时。培养基混合，是传统实验设计方法的替代方法，允许同时优化培养基中的多个成分，已经成为一种常用的方法。此外，成功的培养基配方需要可靠的分析方法，如毛细管电泳、与质谱联用的高效液相色谱（HPLC）和气相色谱，以量化整个培养期间培养基中存在的代谢物。
然而，今天的新技术，例如高通量微阵列分析，涉及一种整合方法来分析整个培养基，而不是单独测量这些代谢物和离子。微阵列分析（EMD MilliporeSigma）可以用来识别细胞响应的培养基成分，这种方法减少了随机测试的需要。一些细胞培养基的制造商得到了生物技术公司的支持，因此为药物制造商提供了用于培养基优化的高通量技术（例如，MilliporeSigma，Sartorius）。鉴于建模能够减少额外研究或实验分析的需要，它为培养基开发领域提供了许多机会，可以显著减少时间和成本。有了这样的化学计量模型和动力学模型，细胞培养过程中的在线或内联分析可以为这些模型提供有价值的输入，以优化培养基甚至进料溶液，以建立更强大的过程。从这种方法来看，公司可以为他们特定的细胞系创建他们的平台细胞培养基。
细胞培养基优化进一步迎合了利用间歇进料（主要是特定培养基成分的浓缩物）的分批进料过程。然而，鉴于对培养基的大量需求，为培养基准备提供具有成本效益的解决方案对于灌注培养至关重要。细胞培养基中的浓缩物是减少操作足迹的一个选择；例如，其成分浓度是原始量的三到四倍的培养基将相当于大约60,000-70,000升，这可以轻松支持灌注过程，提供显著的空间，并减少资源利用。或者，专门设计用于灌注过程的培养基也是满足灌注过程培养基需求的另一个选择。这种培养基将更适合支持高细胞密度，提高体积生产力，并降低成本（降低灌注率），而不是适应用于分批进料过程的培养基（表4.1）。
2.3.高细胞密度冷冻保存
细胞库制造是过程强化的最佳机会。简而言之，在典型的哺乳动物细胞库过程中，从高细胞密度细胞库中解冻的冷冻细胞小瓶被解冻，并将细胞接种到至少25毫升的培养基中。随后扩大种子培养以产生足够的细胞以进行银行存款。在工业实践中，通常每瓶使用大约100万个细胞。与商业目的的生产生物反应器的放大相比，从瓶子到生产生物反应器所需的放大因子或种子列车的数量是高的。这个过程耗时且可能需要额外的资源和措施，以确保种子生成阶段没有失败。种子扩展阶段大约需要20-30天，从低密度细胞库到生产生物反应器。为了抵消额外的时间和处理，最近使用高密度细胞库来加速过程，通过在解冻时提供更大的工作体积。使用高密度细胞库来接种第一个种子列车生物反应器（N-3生物反应器）可以显著减少时间。例如，使用100-150毫升高密度细胞袋（冷冻保存）在50-100×10^6细胞/毫升可以减少种子扩展过程10天至2周。这种创新过程消除了处理多个小瓶的需要，最小化了细胞密度的变异性，降低了污染风险，最重要的是，显著减少了启动生产生物反应器的时间。在高细胞密度冷冻保存中，最好使用一种特定的培养基，能够在确保由于冷冻-解冻而没有细胞损伤的情况下支持高细胞密度。此外，目前正处于开发阶段的现代技术，用于设计能够处理大量细胞冷冻和银行存款的一次性袋组件（氟聚合物2D袋）。
2.4.细胞培养操作
过去几十年主要集中在分批培养上。虽然灌注系统是可用的，但业界并没有广泛采用它们，主要是因为需要大量的培养基和容器容量来支持高细胞密度和增加的生产力。尽管分批培养中可实现的细胞密度相对较低，但提高生产力的进步使得分批培养过程长时间持续使用。随着需要降低制造成本和设施以获得更大的灵活性，稳态灌注和基于灌注的过程，包括浓缩分批进料，现在正被越来越多的一次性技术采用所推动。种子列车和生产阶段的灌注过程可以使体积生产力增加三倍。通过灌注操作实现上游过程强化，如通过减少所需的生物反应器的大小和数量来压缩种子列车持续时间，最大限度地利用生物反应器，增加体积生产力，并减少整体足迹，从而最大限度地提高设施利用率和效率。
N-1灌注，是种子列车强化的一种形式，指的是在生产生物反应器（N）之前的步骤中加强细胞生长。在N-1灌注中，通过将细胞保留装置连接到N-1生物反应器来实现高细胞密度和活力，从而在更高的起始细胞密度下播种生产生物反应器，并缩短生产生物反应器的运行时间。这种修改可以显著增加设施产量，而无需直接改变核心生产过程。需要一个强大的细胞保留装置来获得生产生物反应器的高密度细胞接种物。
N-1灌注的好处包括: • 提高分批进料过程效率。
• 节省时间和成本效益。
• 降低操作风险。
• 更小的生物反应器足迹。
N-1灌注可以通过两种方式帮助优化分批进料生产：
• 通过将细胞保留装置连接到N-1生物反应器，实现生产生物反应器（N）的高细胞密度播种。
• 通过保持细胞保留装置持续连接到N-2生物反应器来移除N-1生物反应器，前提是N-2生物反应器可以为生产生物反应器（N）提供足够的细胞。
N-1生物反应器是最广泛使用的灌注应用。增加N-1生物反应器的细胞密度允许以高播种密度启动生产生物反应器，并可能减少生物反应器的整体循环时间以实现所需的滴度。更高的生产力和从单个N-1生物反应器接种多个生产生物反应器的可能性可以增加整体上游容量和生产量。这种增加的生产也可以通过减少足迹来实现；例如，传统过程需要20,000升生物反应器，现在可以配备2,000升灌注生物反应器。此外，使用一次性组件消除了清洁验证的需要，即原位清洁（CIP）/原位蒸汽灭菌（SIP）。此外，基于灌注的过程可以进一步扩展到N-3种子列车和高细胞密度冷冻保存，如前所述。一次性袋中大约150-500毫升的高细胞密度培养可以在储存期间冷冻，然后解冻以接种种子生物反应器，从而消除了摇瓶和漫长的种子扩展步骤。
灌注可以显著增加N-1生物反应器的细胞密度，并加速生产过程以提高效率。当将灌注培养引入种子列车以增加细胞密度时，它可以减少所需的生物反应器数量或达到收获时所需滴度所需的时间。
另一种允许过程强化的应用是强化分批进料模式或浓缩分批进料模式。浓缩分批进料过程与灌注培养非常相似，只是不涉及细胞和产品的循环。用于浓缩分批进料过程的生产生物反应器装有中空纤维过滤器和交替切向流泵，与灌注中使用的生物反应器非常相似。然而，应选择过滤器孔径，以便生物反应器可以保留细胞和产品。对于抗体生产，使用30-kDa过滤器。该过程通常以分批进料模式开始，只有在生产周期结束时才开始循环细胞和产品。与灌注培养类似，浓缩分批进料过程在高细胞密度和单次操作收获方面具有优势，避免了滴度稀释。浓缩分批进料应用最广泛报道的例子是PERCIVIA，这是Crucell和DSM之间的合作。使用浓缩分批过程中的PER.C6细胞进行的PERCIVIA实验显示出显著的高产量，达到27 g/L。
提高的生产力允许开发更小的设施，并在与一次性技术（SUT）结合使用时提高过程效率。药物制造商可以利用这些优势进入现有基础设施，同时增加保持竞争力的能力。
2.5.生物反应器周期
生产生物反应器在设施生产期间构成了显著的限制。过程持续时间（通常大约2周的分批进料过程）在工业设施中通常是限制步骤，因为所有其他上游和下游过程步骤只需要几天。因此，应立即研究在生产前使用灌注培养。典型的净结果是在生产阶段接种时密度更高，过程持续时间更短，滴度和产品质量相似。因此，生产过程更具生产力，整体设施体积生产力更高。挑战在于优化灌注培养基以在不增加设施中罕见的大体积培养基准备的负担的情况下为生产生物反应器生成所需的细胞。关键参数是随时间实现的细胞密度和细胞特异性生产力，分别决定了细胞培养过程中产生的整体细胞和产品质量。
上游过程强化的另一个应用是种子列车。这里，一种新兴策略是在放大过程中使用灌注培养代替批处理模式。简而言之，灌注培养可以生长到非常高的细胞密度，从而只需要很少的中间放大步骤就可以接种生产规模的反应器。例如，10升灌注培养，每毫升6000万个细胞，可以直接接种2000升反应器，初始细胞密度为每毫升300万个细胞。更传统的批处理放大过程将包括50升、200升和500升规模的中间容器。另一个方面是，高密度种子培养可以在高初始种子细胞浓度下接种生产培养。这可以减少生产滞后阶段，并显著缩短生产过程。更短的过程可以每年实现更多生产批次，更好地利用设施。特制的冷冻袋消除了开放的细胞培养操作步骤，导致种子列车扩展的更好重复性，并分离了细胞扩展和批处理生产，允许从中央扩展设施向全球生产设施分发细胞。
3.一次性技术
对SUT的最初犹豫已迅速转变为广泛认识到一次性用品的多种优势，包括灵活性增加和前期投资减少。完全基于一次性技术生产的制造套件和生产工厂越来越普遍，具有一次性技术的敏捷和灵活设施正在更快地建设。
这些上游技术应在整体生产过程时间表和每年生产的批次数量中平衡培养基和SUT成本，同时考虑处理时间。使用SUT的较小生物反应器可以提供灵活性。由于更换时间和清洁验证的限制较少，因此可以在设施中运行更多的批次和产品。
SUT在过去几年中已经发生了显著变化，并一直在不断创新。包含SUT的设施或使用一次性组件的过程可以快速配置不同的流程并在批次之间切换 - 这种智能实施为药物制造商提供了增加的容量和增强的灵活性。
虽然SUT围绕设备，但设施及其SUT设计也极为重要。设施足迹和操作简便性是关键特性，目前，集成模块化设施已变得流行，特别是当制造商想要保留一些经典设施的特性时。预配置设置允许更快地建立制造场所。
SUT有助于在一个制造地点开发过程，并在建立设施后轻松转移/搬迁到第二个地点。这是通过将平台流程与一次性组件结合来实现的，从而减少了流程开发时间和设备规范、适用性和并行活动的投入。
SUT供应商不断改进现有系统，例如，一种设备（来自EMD Millipore的Smart Flexware系统）的多次使用，用于多个操作。这些系统与色谱和切向流过滤（TFF）操作兼容，所有这些都减少了足迹和投资。比较分析表明，与不锈钢相比，SUT至少可以减少15%的总体成本。一次性组件的新技术显示出增加的过程鲁棒性，由于自动化而更好的过程控制，灵活性，总体成本降低，以及销售成本降低。
生物制药制造中监管机构的一个关键关注点是确保批次之间没有交叉污染。这种cGMP关注在生物制品制造中很难解决，因为不能依赖清洁验证来确保只有以前批次的痕迹物质。因为即使是少量的污染物也会影响蛋白质结构，清洁验证问题对生物制品比对化学药品更为严重。此外，需求的增加也使得简单、快速且低成本的生产系统成为必要。
与传统的不锈钢系统相比，SUT已经解决了其中的一些挑战。过去三十年中开发了技术，主要供应商如Pall、Sartorius和Millipore带头开发了预先灭菌、伽马辐照的一次性产品，消除了进行清洁验证练习的需要。
这一类别的最早SUT产品就像过滤器一样简单。不久，这些产品成为了标准组件：今天，生物加工中使用的过滤器超过95%是一次性的。然后将重点转移到与生物反应器和色谱技术纯化相关的其他过程组件上。对过程的额外改进，包括高滴度和过程强化，有助于在相对较小的规模（10,000升不锈钢生物反应器与2000升一次性生物反应器）上运行。SUT在成本效益、更小高效的设施、批次之间更快的周转时间以及消除CIP和SIP方面具有优势，因此在生物制药制造的重大革命中获得了认可。
一次性使用技术（SUT）组件支持生物制药制造的各个生产阶段，包括克隆选择、细胞库、上游和下游工艺开发、GMP生产、配方和灌装-完成。SUT与平台流程的结合使得从克隆选择快速进展到GMP产品的生产成为可能。SUT的采用正逐渐加快，特别是在小规模或临床规模生产中。直到最近，一次性系统没有能力处理大批量，但包括TFF和色谱系统在内的新系统具备了这种能力。
虽然监管机构不推荐在制造中使用一次性或可丢弃物品，但制造商有责任确保符合交叉污染限制。当满足这些要求所需的成本和时间变得繁重时，一次性或可丢弃物品的成本就成为一个需要认真考虑的方面。美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品评估机构（EMEA）强烈敦促制造商创造一个无菌环境以防止污染物的进入，而不是清洁该区域并通过验证协议证明清洁的有效性。监管当局的这种立场在20世纪70年代随着来自人和动物组织的药品制剂中病毒污染的曝光而变得更加严厉。一些无法遵守新要求的制造商不得不关闭。传染性海绵状脑病的爆发进一步增加了复杂性，因此，在符合cGMP的设施中生产生物药品变得过于昂贵。然而，SUT面临的最大挑战之一是缺乏有关这些系统资格要求的监管指导。
SUT在安全性、环保性、成本效益（尤其是资本成本）、灵活性方面具有优势。然而，在主流制造中存在挑战，特别是关于所使用的材料质量、可扩展性、运行成本、这些组件可能实现的自动化程度、对供应商链的依赖、可提取物和可沥出物的测试以及培训员工将这些组件融入已建立的生物加工系统中的问题。
虽然欧洲药品管理局已经批准了使用SUT生产的疫苗，但美国FDA尚未批准使用SUT生产的任何产品，有几项申请正在等待批准。
3.1.容器和混合系统
一次性或单次使用的袋系统被广泛采用作为硬壁容器的替代品。这是因为，从历史上看，药品产品，如无菌静脉注射溶液、血液、血浆、血浆扩容剂和高营养溶液，都是储存在一次性袋子中并进行分配的。一次性袋子通常有一个由聚氯乙烯或乙烯-醋酸乙烯酯制成的单层膜，用于储存血液。在生物制造中，一次性容器包括瓶子、2D和3D袋子、双层和三层生物加工袋（用于储存培养基）；冷冻保存袋；用于缓冲液和溶液的罐衬里；混合袋；和微载体过滤袋。混合过程中的典型步骤包括溶解缓冲液或培养基的成分、溶液的重新折叠、在生物反应器中分散细胞培养以及液体的加热或冷却。
3.2.桶、容器和罐衬里
罐衬里是用于衬里容器和运输载体系统的简单一次性（可处置）袋子。在大多数情况下，它们没有经过伽马灭菌，因为它们用于开放系统，如在初始阶段准备缓冲溶液和培养基。然而，这些罐衬里也有预先灭菌的版本。罐衬里是专用不锈钢或聚罐和桶的经济有效的替代品。罐衬里外的容器仅提供机械支持。轮廓衬里减少了清洁验证和传统容器的灭菌的需要。罐衬里最重要的优点是，由于它们仅单次使用，不同产品之间交叉污染的可能性很低。
对于较小的体积，有单次使用的容器（容量范围：50毫升至20升）带有集成的手柄、集成的悬挂能力和无针采样口。这些容器可以使用无菌焊接器，并被称为集合管系统。
圆柱形罐的衬里（容量范围：50至750升）可提供2D和3D设计以及顶部或底部排水，并适合大多数行业标准的圆柱形罐。罐衬里通常根据cGMP要求在ISO认证的无菌室中制造，以最小化生物负荷和其他颗粒物质的污染。使用罐衬里消除了预清洁和后清洁的需要，从而减少了周期时间。它们广泛用于水合粉末介质和准备缓冲液和其他非无菌溶液。
商业上可用的高架混合器可以很容易地与当前可用的大多数罐衬里集成，因为这些衬里是开放系统。然而，罐衬里被设计为只在特定混合系统中运行，其中叶轮是从底部供电的。通常，不涉及袋子内部（2D或3D袋子）的机械部件的混合系统更受青睐，以减少成本或最小化由于旋转设备、研磨袋子或袋子内部的搅拌器而对袋子造成损害的风险。使用磁场进行搅拌的搅拌系统比磁性耦合的系统提供更无菌的条件。
混合系统也可以与负载单元（如温度传感器）集成。此外，罐衬里可能有用于pH测量（可重复使用和单次使用）和采样口的设施。重量测量（负载单元）是罐衬里最重要的特性。虽然大多数制造商会使用地板秤，但大规模生产需要在外部容器中安装负载单元，以避免移动容器进行称重。值得注意的是，更昂贵的系统具有编程元素，可能会使过程分析技术（PAT）工作更容易。然而，在缓冲液和介质准备过程中，只有少数挑战可以通过实施最简单和最便宜的系统来克服。
几个主要设备供应商提供完整的混合系统。虽然这些系统在一致处理大体积方面具有优势，但这些生产线可以由客户设计，不需要设备供应商的帮助。目前，有广泛的低密度聚乙烯（PE）衬里用于工业应用，如HyPerforma™（Thermo Fisher Scientific），Mobius®一次性混合系统（EMD Millipore）和Flexel 3D（Sartorius）。
3.2.1.二维袋
2D袋是无菌的、即用型小容量袋（容量范围：5毫升至50升，超过这个范围将难以处理）。这些袋子设计用于储存、采样、过滤和运输培养基、缓冲液、澄清收获物、中间产品、药物和药品。这些袋子还配备了与其它无菌一次性系统以无菌方式连接的端口。在某些情况下，2D袋用于储存粉末（如缓冲盐、活性药物成分和辅料）：这些袋子有漏斗形状，并配备了大型卫生配件或无菌转移系统，并且防静电和无添加剂。
2D袋的设计在更大规模时会造成限制；很难保持它们的完整性，导致处理和运输问题。当填充到最大容量时，2D袋的密封可能不紧密，因为液体重量转移到这些袋子的接缝上。当2D袋在混合过程中被摇晃时，这尤其成问题，这给接缝增加了额外的压力。
3.2.2.三维袋
三维袋作为硬壁容器中的衬里，避免了2D袋遇到的问题；三维袋有不同尺寸可供选择。三维袋的设计还提供了额外的表面来安装具有复杂功能的端口。三维袋由焊接膜制成，通常提供圆柱形、圆锥形或立方体形状。这种形状通常由这些容器在外部容器中的存放或堆叠方式决定，这允许三维袋紧贴容器。这些三维袋设计用于储存和运输大量溶液。它们以无菌状态供应，准备用于快速过程实施。
一次性袋子可以方便地用于运输或储存冷冻产品，范围从直接进入生物反应器的工作细胞库的细胞培养到运输生物活性药物成分。相比之下，柔性袋可以承受温度变化；通常，在运输过程中很难发现对它们的损坏，因此需要在它们周围提供保护表面以防止这种风险。
塑料一次性容器提供了使用一次性组件的最佳替代解决方案，因为它们消除了清洁和验证要求。低密度聚乙烯（PE）衬里在硬壁塑料容器和标准搅拌器中是准备缓冲液和介质的最便宜组合。更复杂的混合系统是不必要的，也不是昂贵的专有容器来容纳这些PE衬里。
3.3.一次性技术的优势
采用一次性或混合系统代表了更快、更灵活、资本要求更低的途径。每种选择的成本和收益应与现有基础设施、技术限制和生产量要求进行权衡。一次性制造系统与传统不锈钢设备相比提供了多种优势，如下所示：
• 提高上市速度。
• 减少资本：设备和设施的利用率更高，批次数量增加。
• 减少/消除清洁和验证成本：生物制造设施每天可以消耗大约800,000加仑的水，其中大部分用于执行SIP/CIP和操作灭菌器 - 在下一代一次性系统中这些都不需要。
• 消除残留。
• 提高灵活性，适用于多产品和批次规模的设施以及更快的周转 - 成本更低，灵活的容量轻松适应不断变化的规模，并适应新的形式。当与模块化设施结合使用时，SUT允许即插即用方法。
• 降低交叉污染风险：这允许单元操作连接，从而消除开放处理。这允许并行步骤处理甚至考虑多个产品处理。考虑特定过程步骤的一次性选项的成本效益评估应包括它可能对其他过程步骤（例如，先前和后续步骤）的影响。成本分析应包括端到端过程制造成本，并与不锈钢过程的固定成本进行比较。也许，一次性物品更广泛接受的最大障碍来自于制造商无法放弃他们在固定设备和系统上的巨大投资，这些投资相对较新（20世纪70年代和80年代）。因此，变化发生在较小的公司、研究组织和合同公司。然而，这种情况即将发生快速变化。大型制药公司可以接受的高生产成本现在必须受到挑战，因为畅销重组药物的专利已经开始到期，这使得较小的公司可以在成本上竞争 - 生物仿制药业务应该说服行业接受生物加工的未来。此外，还涉及环境考虑。
上游和下游加工中创新的一次性方法的整合提供了开发灵活且占地面积小的设施的机会，这最终有利于制造成本效益高且价格合理的药物。从开始到结束完全建立在一次性和一次性系统上的设施。一些分析报告称，一次性设施的运营成本（大约22%，Levine 2013）比不锈钢设施低。图4.1展示了一个示意图，显示了从开始到结束使用一次性系统构建的所有制造操作。
3.4.一次性生物反应器
生物加工的科学和艺术可以追溯到几千年前，结合了生物制剂的更新模式，特别是生物制药的多样化产品范围。从毫克规模的台式技术到公斤规模的工业生产的细胞培养的转变几乎花了二十年的时间。当今生物制药时代体现在在不锈钢生物反应器中生产大量生物制剂。今天，这些大规模搅拌罐生物反应器（10,000-100,000升规模）代表了现代哺乳动物细胞培养技术，是生物制药行业的重要工作马。
不锈钢生物反应器已被用于生物产品制造数百年。这些生物反应器的基本要素，即在充分混合和曝气下容纳培养基和介质的容器，通过其传统设计轻松提供。今天，生物反应器的设计有多种选择。当生物反应器在制造生物药品时扩展，需要许多其他行业不需要或不需要的控制功能时，这些选择变得可用。随着动物、人类和植物细胞和病毒成为生产治疗蛋白、疫苗和抗体的来源，有必要修改传统生物反应器以适应这些新生产引擎的日益增长的需求：重组工程技术的应用使这些新引擎成为生物药品生产的前沿。生物反应器设计的一个主要近期变化是使用一次性生物反应器（SUBs）以避免清洁验证方面的挑战，这降低了药品生产的监管障碍。数百种新分子正在使用一次性生物反应器开发，并且在许多情况下，一次性生物反应器用于生产临床供应品。
市场上几乎所有现有的重组药物都是由大约40年前开始的大型制药公司开发的，当时传统生物反应器是唯一的选择；尽管它们的流程可能效率较低，但由于需要完成的转换协议的成本过高，不值得转换到另一种制造方法。
随着一次性生物反应器的灵活性增加，转换时间的显著减少是一个显著的好处。例如，200升生物反应器的转换时间已减少到2-3小时，而不是不锈钢生物反应器的24-48小时。
SUBs有多种设计和用途，但它们都是由VI类塑料膜制成，通过伽马辐射灭菌并在使用后处置。这些生物反应器可能有几个附件，允许过滤介质并监测pH值、溶解氧（DO）、氧气需求、pCO2、温度和其他与PAT相关的参数。在SUBs中，袋内的混合和曝气是通过使用搅拌器、桨叶以及通过机械或液压手段摇动和旋转袋子来实现的，这与传统不锈钢罐中的效果一样，并且在某些情况下，对培养的压力较小。
SUBs有多种尺寸可供选择，容量范围从毫升到数千升。它们的结构可以从非常简单到非常复杂，即它们也可以配备控制系统，无论是手动操作还是高度自动化。它们可以像塑料袋一样便宜，也可以像高端传统硬壁生物反应器一样昂贵。
一次性生物反应器领域仍在不断发展，几乎不断有新发明出现。例如，用塑料板、聚丙烯烧瓶和特氟龙袋分别替代玻璃培养皿、T型烧瓶、滚筒瓶或玻璃烧瓶，用于小规模的细菌、酵母培养、一次性中空纤维系统、波纹生物反应器和搅拌的3D反应器。
搅拌机制的类型包括连接到电机的机械搅拌器、磁悬浮搅拌器、不与电机接触的搅拌器、底部的磁搅拌器、摩擦表面的搅拌器和从顶部插入的机械搅拌器。摇摆波纹运动是最常见的搅拌机制；由WAVE Bioreactor首创，已有几家设备供应商采用了这种系统。静态生物反应器概念与通常需要移动平板的波纹运动截然不同；在这里，袋子保持静止。相反，一个拍打器压下一次性袋子的一边。
3D一次性搅拌罐式反应器系统已成功模仿传统的不锈钢生物反应器。3D一次性系统的尺寸、比例、通气系统和混合系统与经典的不锈钢系统（可重复使用）相似。SUBs配备了一个散气环或微散气器和两个轴流三叶段式叶轮或一个轴流三叶段式和一个径流六叶段式叶轮。中心的搅拌系统在袋子内实现均匀混合。所有SUBs都促进混合、通气、排气和温度监测。生物反应器袋有pH和DO监测（一次性和可重复使用）、采样、液体转移、接种口和收获口。SUBs通过标准的无菌连接具有即插即用设置和操作，与行业广泛使用的主要控制平台轻松集成。SUBs减少了清洁和灭菌的需要，降低了交叉污染的风险。广泛的体积范围使SUBs适用于工艺开发、临床生产和大规模cGMP生产（见图4.2）。
2D一次性生物反应器，如特定于WAVE系统的Cellbag已被成功使用。这些生物反应器袋使用摇摆运动进行搅拌。这些袋子由两层膜制成，两端焊接在一起。所得结构是一个扁平的室，带有端口，其任一面或端部都被焊接。由于在大规模上搅拌和曝气的限制和挑战，这些WAVE生物反应器主要用于种子列车步骤。此外，WAVE生物反应器取代了首批一次性生物反应器，如滚筒瓶、细胞工厂和中空纤维生物反应器。这是因为大多数动物和人类细胞是在无血清培养基中悬浮培养的，因为由于产品滴度的增加，细胞培养生物反应器体积目前正在缩小。
将非侵入性光学传感器技术应用于动物细胞的透明培养容器，实现了高度自动化或精确监测和控制的一次性微生物反应器系统。这为早期工艺开发从无监测到良好特征化和控制的转变铺平了道路，并对准确复制更大规模条件做出了重要贡献。
在制药行业，人们认为当前向安全、个性化药物（例如，个性化抗体、用于癌症、免疫和组织替代治疗的功能细胞）的推动将有助于一次性生物反应器的持续增长。当必须在尽可能短的时间内实现优化的细胞密度和产品滴度时，细胞培养技术专家应该愿意偏离他们的黄金标准方法，即使用搅拌系统。除了高度仪器化、可扩展的波纹混合和搅拌SUBs外，轨道摇动的一次性生物反应器和PBS Biotech或BaySHAKE等新方法的使用也越来越多。
生物反应器制造商（Thermo Fisher Scientific，Cytiva [前身为GE Life Sciences]，Eppendorf和Sartorius）已经展示了SUBs在培养细菌和支持高密度哺乳动物培养方面的成功应用。
3.5.其他组件
根据FDA行业指南（www.fda.gov/media/71012/download），PAT旨在支持创新和提高药物开发效率。PAT是一个通过及时测量（即在处理过程中）原料和在制品以及过程的关键质量属性和性能属性来设计、分析和控制制造的系统，以确保最终产品质量。PAT中的“分析”一词被广泛理解为包括化学、物理、微生物、数学和风险分析的综合方法。
一次性传感器，要么集成到SUB中，要么包含在盖子中，并随生物反应器一起处置，必须满足过程要求。它们提供连续信号并提供有关任何阶段细胞培养状态的信息。
由于一次性生物反应器是这个行业的新生应用，首次尝试监测生物反应器的产品是使用传统生物传感器，这些传感器用于测量生物反应器的温度、DO、pH、电导率和渗透压。这些探头必须首先进行灭菌（高压灭菌），然后连接到焊接到生物反应器袋中的穿透适配器配件。不足为奇，这是一个劳动密集型和耗时的过程，可能会影响SUB袋的完整性和无菌性。然而，由于SUBs的技术革新和进步，可重复使用的生物传感器的使用已基本被真正的一次性传感器所取代。通常监测的关键过程参数包括压力、pH、DO、细胞密度和紫外（UV）吸收。包含用于监测这些参数的传统技术的包装通常由于多种原因与一次性组件集成不兼容或无效：成本、交叉污染、无法保持封闭系统以及与伽马辐照不兼容。由于这些挑战，一些测量是离线进行的。
采用一次性传感器需要敏锐地了解其需求和利用。它们的适用性和目的将由它们的材料属性、传感器制造、过程兼容性、性能要求、控制系统集成、使用前处理的兼容性以及监管要求来决定。尽管这些障碍并不总是妨碍使用传统的测量技术，但用于监测过程参数的一次性解决方案消除了清洁设备和高压灭菌小部件的需要，降低了建立过程连接的风险和成本，并且可能比传统技术更具成本效益。例如，一个合格的卫生、可高压灭菌的压力传感器，需要一定数量的高压灭菌周期和重新校准，可能比一次性压力传感器更昂贵。
一次性传感器以两种模式使用：一种是传感器原位放置与液体接触，另一种是外部传感器与介质接触，要么是光学（离线）要么是通过无菌（一次性）样品移除系统（在线）。一次性传感器必须可灭菌或预先灭菌（如果它们与介质接触），具有成本效益且可靠。新设计使用便宜的感测元件放置在一次性生物反应器内，并与反应器外的可重复使用（更昂贵）分析设备结合。便宜的一次性传感器可以放置在晶体管上或内部空间、入口、出口或培养肉汤中进行液相分析（用于监测温度、pH和pO2）。这些一次性传感器也可以是光学传感器，允许通过透明窗口进行非侵入性监测。
3.5.1.光学传感器
光学传感器的工作原理是电磁波对分子的影响。使用光学传感器是一种完全非侵入性的方法，可以同时提供许多参数的连续结果。使用它们相对容易，因为它们可以通过生物反应器中的透明窗口看到。系统的探测器部分可以物理分离，这有助于利用昂贵的分析设备，允许光学传感器原位或在线使用。
荧光传感器可以针对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）测量、生物量估计以及区分有氧和无氧代谢进行优化。2D荧光测量通过扫描一系列激发和发射波长，同时测量多种分析物，包括蛋白质、维生素、辅酶、生物量、葡萄糖和代谢物（如乙醇、腺苷-5'-三磷酸[ATP]和丙酮酸）。因此，荧光测量可以用来表征上游过程。通常，连接到生物反应器的光纤光学灯通过生物反应器中的玻璃窗口发光。荧光测量检测的一个例子是BioView系统（www.bioview.com）。BioView传感器是一种用于生物技术、制药、化学、食品生产和环境监测的多通道荧光检测系统。它不仅检测特定化合物，还检测微生物及其化学环境的状态，而不会干扰样品。BioView系统直接在过程中在线测量荧光。干扰样品被消除，这降低了污染风险。然而，鉴于多种成分的光谱复杂性，需要高水平的分辨率编程。
生物反应器中存在的许多代谢产物可以通过红外（IR）光谱法轻易检测。然而，用于生物量分析的被水吸收的IR光束可以是近红外（NIR）或SiRhodamine，当用于传输模式时。NIR传输探头和衰减全反射-IR探头现在可以商业获得用于生物反应器。这些探头通过卤素银纤维或射频连接器连接。
除了IR和荧光检测外，还使用基于光致发光、反射和吸收的光学方法。光学电极或光电极可以通过玻璃纤维连接到生物反应器，将测量设备留在生物反应器外面，类似于荧光探测器的设置，允许这些化学传感器原位或在线使用。
氧气传感器通过产生分子氧来熄灭荧光；对于熄灭测量，将荧光染料（金属配合物）固定并连接到光纤的一端，光纤的另一端与激发光源接口。荧光的持续时间和强度取决于环境中染料周围的分子氧浓度。发射的荧光被收集并传输以在生物反应器外部进行解释。这些电极比传统的铂探针电极更适合检测分子氧，并且它们可以用于液体和气体阶段。PreSens（www.presens.de）是一个非侵入性氧气传感器的例子，用于测量DO和气态氧的分压。传感器点固定在玻璃器皿或透明塑料材料（一次性使用）的内表面。因此，可以通过容器壁从外部以非侵入性和非破坏性方式测量分子氧浓度。不同浓度范围的不同涂层都是可用的。它提供DO浓度的在线监测，范围从1 ppb到45 ppm，依赖于流速和气相中的氧气测量。这些涂层可以高压灭菌。
Ocean Optics（www.oceanoptics.com）提供了世界上第一个微型光谱仪，配备了用于气相中氧气和pH检测的广泛传感器阵列。
pH传感器的作用基于它们的吸收或荧光特性。光纤pH测量是基于荧光和吸收型pH指示剂进行的。荧光型测量最常用的染料是8-羟基-1,3,6-吡嗪三磺酸和荧光素衍生物，而酚红和甲酚红用于吸收型测量。荧光染料对离子强度敏感，这限制了它们用于宽范围pH测量（pH超过3 U）。
CO2传感器的工作原理是测量嵌入在CO2可渗透膜中的碳酸盐缓冲液的pH值。传感器的反应时间较长，而季铵氢氧化物提供了更快的响应。
基于荧光的传感器具有吸引力，因为它们有助于开发便携式和低成本的系统，可以轻松部署在实验室环境之外。与未参考的荧光强度测量不同，这些测量对染料浓度变化、浸出和荧光团光漂白以及仪器波动不敏感。传感器系统的性能以高度重复性、可逆性和稳定性为特征。
3.5.2.生物量传感器
可以使用浊度传感器获取有关生物量浓度的信息。通常，这些传感器基于散射光的原理。大多数浊度传感器的缺点是只有低颗粒浓度才具有线性相关性，但使用背向散射光（180°）的传感器具有高颗粒浓度的线性特性。一次性生物反应器中需要一个半透明窗口，以便检查IR区域中所需的波长。S3 Mini-Remote Futura系列生物量检测器（www.applikonbio.com）将传感器内置于一次性生物反应器中。这个传感器系统使用超轻型前置放大器连接到ABER一次性探头（www.bioprocess-eng.co.uk/product/aber-futura-pico/）。
3.5.3.电化学传感器
电化学传感器包括电位、电导和伏安法传感器。厚膜和薄膜传感器以及化学敏感场效应晶体管（ChemFETs）具有作为生物过程控制中一次性电位传感器的潜力，因为它们可以便宜且大量生产。
许多pH传感系统依赖于安培法方法，但它们需要不断校准，因为它们不稳定或漂移。大多数安培法传感器的设置基于电极表面膜或膜的pH依赖选择性。
虽然浊度传感器检测总生物量浓度，但电容传感器提供有关活细胞质量的特定信息。电电容和电导通常表征细胞在交流电场中的电气特性。细胞膜完整性对估计只有活细胞的电抗有显著影响。Hamilton的Biodis系列（www.hamiltoncompany.com）和Aber（www.aberinstruments.com）用于监测一次性应用中的活生物量。Eppendorf（www.eppendorf.com）生产了一个集成版本。
3.5.4.压力传感器
压力是生物过程单元操作期间经常监测的另一个重要过程参数，如过滤、色谱和许多其他程序。传统的不锈钢压力表可以与一次性实验装置结合使用，但这种组合的缺点是压力表必须单独灭菌。此外，将传感器连接到先前伽马辐照的一次性组件可能会引起问题。
许多生物过程单元操作具有内置的压力控制系统，以避免重大的压力相关安全问题。在传统的不锈钢反应器中，压力被监测和严格控制，因为压力可以影响质量传递并防止污染。此外，高压事件是一个潜在的危险情况。生物反应器中堵塞的通风滤器很容易导致袋子破裂、反应器内容物溢出以及操作者暴露于未加工的散装物料中。
压力监测对过程性能至关重要的另一个应用是深度和无菌过滤。过滤器的能力主要通过流量衰减或压力增加来测量。然而，将可重复使用的传统的压力传感器添加到过程列车中会破坏使用一次性过程设置的目的。根据过程应用，传统设备的接触表面需要消毒或湿热灭菌。
传统的设备通过SIP进行灭菌，其中产品接触表面在可以放置在高压灭菌器中的设备中暴露于蒸汽灭菌，整个设备暴露于蒸汽中。然而，许多一次性过程组件与湿热灭菌温度不兼容，这就需要单独灭菌不锈钢设备，并且可能无法与预先灭菌的一次性组件进行最佳连接。
一次性压力传感有助于在开发应用和早期临床生产中快速更换产品接触表面。例如，PendoTECH（www.pendotech.com）的一次性压力传感器旨在实现与具有柔性管道作为流体路径的一次性组件的压力测量。这些一次性压力传感器与伽马辐照兼容（高达50 KGy），并且流体路径材料符合美国药典（USP）Class VI指南，并符合EMEA 410 Rev 2指南。
USP Class VI指定被认为是最严格的，因此对医疗应用最有用。它涉及以下三项评估，通常在小鼠或兔子上进行，以模拟人类使用：
• 急性全身毒性（系统性注射）测试：当化合物的样本被口服、皮肤应用或吸入时，该测试测量毒性和刺激。
• 皮内测试：当样本与活的皮下组织（具体来说，是预期与医疗设备接触的组织）接触时，该测试测量毒性和局部刺激。
• 植入测试：该测试测量将化合物肌肉内植入测试动物模型数天的毒性、感染和刺激。
为了确认化合物具有极低的毒性水平，将对其进行这三项测试，并将其暴露于不同温度下的评估特定时间。符合美国药典（USP）Class VI标准的材料通常具有高水平的质量，并更好地符合美国食品药品监督管理局（FDA）的要求，因为这些材料引起患者对有毒物质反应的风险要低得多。
USP Class VI测试只是生物相容性的标准之一。然而，尽管不是有限系列的测试，但某些医疗器械的生物相容性要求可能超出USP Class VI所执行的测试。ISO-10993是医疗器械生物评估的更为严格的标准。
ISO-10993是一个包括全身毒性和皮内反应性测试的标准。然而，它还测试了额外的细胞毒性、遗传毒性、慢性毒性、血液相容性，更重要的是全身毒性。不同级别的ISO-10993测试主要适用于将永久性或半永久性植入患者体内的医疗器械。因此，对于不打算植入或与患者接触有限的设备，ISO-10993测试可能比必要的更为广泛。
在一次性生物反应器中，可以在排气管线上安装传感器来测量顶部空间压力。尽管这些传感器被认证可用于高达75 psi的压力，但核心传感器在一次性生物反应器所需的低压范围内显示出准确的值。
3.5.5.采样系统
可以使用无菌过滤器和蠕动泵从生物反应器中连续采样以获得无细胞样品。有预灭菌采样容器可供使用，该容器内含有可以焊接到袋式生物反应器采样模块的无针注射器。样品被泵入这些组件的容器中。需要时可以移除采样容器，并将管子热封。其他采样系统有一个预灭菌的Luer连接，包括一个单向阀，防止样品流回反应器。使用注射器从反应器中抽取样品，并通过采样线将其引导至储液器。例如，Cellexus Biosystems（https://cellexus.com）和Millipore（www.sigmaaldrich.com）使用这样的采样系统。连接到采样线的Cellexus系统最多可以有六个密封的样品袋。然后将储液器中的样品推入袋中，随后由机械密封器分离，从而得到密封、无菌的样品。生物反应器制造商/供应商提供几种可定制选项的采样歧管。
Millipore专有系统包括一个可以安装在几个生物反应器侧端口的端口插入件和几个可以单独打开和关闭的柔性导管用于采样。这些端口连接到灵活的一次性采样容器。每个模块的采样次数限制在每个模块中可用的导管数量。
这些采样系统允许无菌采样，但在每个模块收集的样品数量和缺乏自动化方面受到限制。虽然这些方法有助于获得良好的验证数据，但由于每次抽取样品时都会破坏生物反应器，因此污染风险并未完全消除。因此，需要开发或选择其他不需要与介质接触的方法。
3.5.6.连接器
生物加工的复杂性使得设计无弱点的系统变得困难；污染是一个需要所有连接器、管道和工具连接各个过程步骤并在无菌环境中进行采样的风险。一次性组件最初应用于连接器和管道，因为清洁是一项挑战任务。与硬管路不同，一次性转移管道中使用的柔性管道不需要昂贵且耗时的清洁和验证程序。这允许制造商快速更改过程步骤或将结果转换为新产品。这一特性是多个生产设施的关键优势，其中过程要求根据正在生产的药物类型而变化。
创新制造商现在将一次性管道组件贯穿整个生物过程，从种子列车到最终填充应用。由于减少了劳动力需求以及与清洁和验证相关的化学、水和能源需求，从而实现了额外的成本节省。
然而，在硬壁系统中，仅因为蒸汽用于CIP/SIP操作而使用SIP系统。即便如此，污染风险依然存在。由于这些应用中的许多SUT系统被用于生物医学领域，设备行业一直在监管要求之前。生物相容性问题早已解决，供应商可以提供监管机构可能需要的其设备详细信息。由于这些设备的制造过程复杂，用户不太可能要求定制设计设备；然而，今天可用的多样化选择可以充分修改任何使用现成物品的系统。和以前一样，强调现成物品的重要性超过了定制设计。管连接器和密封器作为一次性袋子用于混合和生物反应器的新进入者；然而，供应商选择有限，主要是Cytiva LifeSciences Sartorius Stedim Biotech。这些设备的成本仍然很高，但另一种选择是使用昂贵的无菌连接器。通常，如果有足够的无菌连接器选择，那么应该优先选择这些连接器而不是管连接器，因为热激活系统总是会创建与连接不良相关的问题。此外，使用无菌连接器允许连接可能不是热敏的管道。
现代生物加工设施将接种物从几毫升培养物中的几百万个细胞扩大到数千升的生产量。这个过程需要在种子列车的每个点进行无菌转移。传统的生物加工设施使用一系列专用的不锈钢生物反应器通过阀门和刚性管道连接在一起来完成放大过程。为了防止生产运行之间的污染，每个生物反应器、容器和管道线路都设计有CIP系统，以去除任何残留物质。这些CIP和SIP系统需要广泛的验证测试，这些系统中的阀门和管道可能会带来额外的与验证相关的挑战。
SUT系统的进步允许生物过程工程师用一次性存储系统和管道组件分别替换大多数存储容器和固定管道网络。一次性系统消除了对许多组件进行CIP验证的需要，并通过消除对昂贵容器、阀门和卫生管道组件的需求，降低了维护和资本成本。
一次性介质存储系统通常用于20升到2500升的体积范围。介质存储系统通常由其制造商通过伽马辐照进行灭菌（在生物加工设施安装之前），并且通常配备集成过滤器、采样系统和连接器。使用一次性数字-模拟连接器（DACs）或与兼容管道的管焊机和密封器，操作员可以在预灭菌的SUBs之间进行无菌连接，以进行介质、细胞和任何其他需要添加的液体的无菌转移。DACs也可用于下游应用。这些无菌连接器可用于高流量和高压应用。
同样，定制的预灭菌一次性管路组件用于通过蠕动泵或施加顶空压力在生物反应器之间转移接种物。使用无菌连接器的柔性管路用作过程中生物反应器之间的转移管线。这种转移管线减少了转移所需的可重复使用阀门数量，并消除了CIP和SIP验证的问题区域。每个预灭菌转移线以一次性SIP连接器结束，提供了与传统固定管道相同的无菌保证，但成本更低。
在某些情况下，液体需要从较高到较低的ISO环境转移，需要强烈的无菌保证（在转移过程中不应有交叉污染）；因此，可以在连接两个区域的墙壁中安装一个管道，较干净的房间有较高的压力。然后，从较低ISO等级的一侧插入预灭菌管到较高ISO等级的一侧，从而形成容器之间的连接，然后通过蠕动泵转移液体。转移完成后，将管子拉入较高ISO等级区域，最后丢弃。这种方法有助于在下游和上游区域之间建立连接，而不会在转移到较低ISO等级区域（如下游区域）时带来污染风险。
3.5.7.管路
柔性管是所有一次性系统的重要组成部分，并且受到前面章节中提到的可提取物和浸出物的安全问题的影响。需要评估柔性管的几个属性，即耐热性、操作温度范围、耐化学性、颜色、密度、邵氏硬度、柔韧性、弹性、表面光滑度、机械稳定性、耐磨损性、气体渗透性、对可见光和紫外线的敏感性、层的组成、焊接性、密封性和通过伽马辐射或高压灭菌器进行灭菌的能力。
生物加工中使用的所有管子都符合USP VI类分类、FDA 21 CFR 177.2600和EP 3A卫生标准。在cGMP生产中，这些被归类为散装药品。
3.5.8.泵
泵通过产生静水压力或差压来转移流体；最大允许工作压力将在生物过程组件中最弱的部分确定。在一些单元操作中，如收获、TFF和色谱法，分子对泵送过程中的任何变化都非常敏感。压力的脉动可能影响被泵送的流体，甚至损坏泵的部件。泵必须满足以下适用性标准：
• 体积小，表面积暴露最小。
• 可提取物和浸出物水平低。
• 控制流量和压力。
• 低剪切和脉动。
• 无机械剥落/脱落接触材料。
• 自吸。
• 无热积累。
• 无菌。
• 高容积效率。永久性的不锈钢工艺管线不仅安装昂贵且复杂，而且还需要广泛的清洁和验证。一些泵使用机械密封，无法保持恒定的流量或无菌，这使得它们不适合处理生物制剂。
目前，一次性泵送解决方案包括蠕动泵、注射泵和隔膜泵。一次性正排量四隔膜泵是生物加工应用的最佳选择之一。这些是体积置换泵，易于使用，避免与产品接触；然而，它们可能会对管路施加压力，特别是当它们长时间运行时。管路上的压力可能导致管路颗粒的侵蚀，从而污染被输送的流体。许多生物药物对剪切敏感，蠕动泵可以通过施加低压和提供温和处理来帮助保护这些药物。相比之下，活塞泵的阀系统通过小孔快速流动，可能会损坏生物产品。即使是无阀活塞泵也施加高压和高剪切因子，最终损害生物产品。
高端蠕动分配泵在改进的无脉动泵头设计、精确的驱动电机和最先进的校准算法方面具有优势。它们在微升填充体积上非常准确。带有一次性管路的蠕动泵消除了交叉污染，不需要清洁验证，因为管路是唯一与产品接触的部分。同样，带有一次性管路的蠕动泵的清洁验证比活塞泵要容易得多。相反，粘性产品可能是蠕动泵的问题。蠕动泵仅施加大约1.3巴的压力，当它们处理粘度高于100 cP的产品时，其准确性会降低。已经对用于下游加工的泵进行了几项改进，包括HPLC、TFF和病毒过滤应用，这些泵可以在所需压力范围内实现高工艺产量（例如，quantum；www.watson-marlow.com/us-en/range/watson-marlow/single-use-pumps/quantum/）。一次性泵通常由袋子而不是不锈钢容器组成，使用特殊搅拌器、一次性管路、耦合辅助器和阀门。一次性组件降低了清洁成本，并消除了广泛的验证。TFF应用提供了即插即用选项。这些泵在工艺所需的压力范围内提供线性流动；它们产生超低剪切，从而提高下游工艺产量。
隔膜泵是一种正排量泵，它使用橡胶、热塑性塑料或特氟龙隔膜的往复运动和适当的止回阀来泵送流体。四隔膜泵由连接器板依次驱动，这些泵非常适合处理所有液体生物制剂，包括粘稠液体。一些泵具有自吸、干运行、恒定流量运行的能力，只涉及低剪切和脉动，并且不涉及任何热积累。
3.5.9.管路焊接机和密封器
在可以使用热塑性管路的情况下，焊接提供了一种简便、经济且非常安全的解决方案。热塑性管路的例子包括C-Flex、PharMed和Bioprene。热塑性管路必须是无菌的，具有相同的尺寸（内径和外径），并且两端必须封盖。将热塑性管路以相反方向平行放置，可以通过使用加热的刀片同时切割管路来密封。刀片应该预热以达到焊接温度，在焊接过程之前实现无菌并脱氢刀片。脱氢程序通常在250°C下持续30秒，或在320°C下持续3秒。管路被切割后，它们被移至彼此相对的位置，以便每个管路连接到无菌系统的端头直接位于刀片的任一侧。焊接周期的持续时间可以从1到4分钟不等，具体取决于材料和管路直径。今天可用的主要焊接系统包括Sterile Tube Fuser（GE Healthcare）、BioWelder（Sartorius Stedim）、Aseptic Sterile Welder 3960（SEBRA，www.sebra.com）、TSCD（Terumo，www.terumotransfusion.com）和SCD 11B（Terumo—Terumo主要为其血液输血目的提供设备）。GE Healthcare和Sartorius Stedim在生物加工行业的安装中处于领先地位。
在断开无菌连接时，连接的两端必须用无菌帽封盖，并且应在层流罩内或使用管路密封器进行此操作；一些例子包括来自PDC（www.pdcbiz.com）、Saint-Gobain（www.saint-gobain.com）、Sartorius Stedim（www.sartorius-stedim.com）、Cytiva（www.cytivalifesciences.com/en/us）、Terumo（www.terumotransfusion.com）和SEBRA（www.sebra.com）的产品。这些密封器中的大多数可以密封直径从0.25英寸到大约1.5英寸的管路，密封过程需要1-4分钟。大多数密封器使用电加热元件操作，但也使用射频密封管路。这些程序不需要使用层流罩。在大多数情况下，在两个地方使用压接机并在压接之间切割管路提供了最便宜的解决方案。
3.6.取样
在生产过程中，通常进行取样以通过验证过程参数（如pH、DO、OD、pCO2等）来确保合规性。大多数一次性系统都有一个或多个集成的取样线，部分配备了特殊的取样阀、取样歧管或特殊的取样系统。流行的一次性取样阀是ICU Medical（www.icumed.com）的Clave连接器，它也用于医疗应用中的血管内导管。通过取样阀，可以使用Luer-Lok注射器轻松收集样品。阀内部的动态密封保证只有在连接注射器时才能收集样品，从而确保样品只与阀的内部无菌部件接触。然而，抽取的样品并不保持无菌。
由取样袋、取样瓶或注射器组成的歧管适用于在一次性系统中收集无菌样品。这些歧管可以通过无菌连接器或管路焊接与系统连接。取样歧管允许在给定期间进行多次取样以进行质量控制。歧管的主要特点是可以显著减少过程中的操作次数。歧管系统以预组装和无菌的方式交付，准备用于工艺使用。只需一个连接就可以允许几个袋子被填充。
此外，还可以使用歧管系统进行取样，歧管的样品容器并行排列，最后一个容器用作废料容器。初始流动和随后的样品被引导到各自的容器中，使用Y型、T型或X型软管柱塞和管路夹。正如预期的，SIP连接还允许将歧管系统连接到传统的不锈钢加工设备。
3.7.下游加工
SUT是最小化批次间停机时间、减轻清洁负担、验证这些程序以及最重要的是批次间污染风险的有吸引力的解决方案。SUT还便于在多产品设施中轻松切换产品线。已经成功用于上游加工的SUT，如柱子、某些一次性硬件系统和一次性流路，已成为下游加工发展不可或缺的一部分。
一次性液相色谱系统，如ÄKTA ready XL色谱系统，具有一次性流路和预装柱子，可以支持大规模商业制造，并方便地满足从一次性2000 L上游工艺开始的容量，具有高滴度。这些系统在技术转移和工艺放大操作中非常有用。
越来越强调支持治疗药物更加负担得起。一次性系统和CM操作是降低整体制造和投资成本的关键驱动因素，使这成为可能。
在下游生物加工中采用一次性组件是一个渐进的过程，偶尔会有一些革命性的高峰。最初，用于正常流动过滤的缓冲袋和设备，包括色谱柱中的病毒和保护过滤器。然而，逐渐地，引入了更复杂的概念，包括TFF和色谱柱的一次性设备用于下游加工。今天，行业已经达成共识，尽管许多上游操作可以转换为完全一次性系统，但至少下游加工的一些元素仍将以传统方式进行，理由如下：（1）柱子和树脂总是太贵而不能丢弃，以及（2）由于柱子可能非常大，找到合适的一次性替代品将非常具有挑战性。然而，正如历史证据所指出的，15年前提出了同样的论点，反对生物反应器转换为一次性设备。今天，下游加工科学的发展速度比上游科学更快；最近，建议使用膜吸附剂进行大规模抗体纯化。这些膜比传统树脂便宜得多。
3.7.1.细胞收获
对于细胞收获和碎片去除，过滤是传统离心的替代方法。目前可用的一次性过滤系统提供了操作的灵活性和可扩展性。它们在易于放大和可用的预灭菌过滤胶囊方面具有优势，可以直接集成到生产线中。尽管这个阶段通常由离心或透镜过滤完成，但深度过滤系统（例如，Millipore Pod过滤器）提供了第一个可用的一次性透镜过滤器；这些吸附性深度过滤器将两种不同的分离技术结合到一个高效操作中，以提高过滤能力和保留率，同时压缩多个过滤步骤。深度过滤器使用多孔过滤介质在整个介质中保留颗粒，而不仅仅是在介质表面。深度过滤器由纤维制成，以网状形式铺展在基底上；特殊添加剂如活性炭、陶瓷纤维等特定组分与粘合剂结合形成过滤器。深度过滤器利用其整个深度基于筛分和吸附效应保留颗粒，与保留性过滤器不同，过滤材料集中在表面。当待过滤的流体有高颗粒负荷时，通常使用这些过滤器，因为与其他类型的过滤器相比，它们在堵塞前可以保留大量颗粒。
通过将多个吊舱插入支架中来实现放大，格式允许1-5或5-30个吊舱，根据需要。进一步的一次性深度过滤器格式包括Pall Life Sciences的Stax-System，Cuno的封装Zetaplus，Sartorius Stedim的L-Drum，Millipore Clarisolve，双开放式高容量和扩展开放式高容量吸附性深度过滤器用于初级和次级澄清。这些过滤器通过减少细胞生物量、宿主细胞蛋白（HCP）和宿主DNA并去除大部分细胞碎片，允许有效的细胞澄清，以便轻松装载到色谱柱中。
深度过滤器的性能取决于生物反应器卸料的胶体含量和上游离心机的细胞碎片去除能力。通常，深度过滤器以恒定流量100-200 L/(m2·h)运行，最多150 L进料/m2的过滤器，具体取决于进料流的组成。Millipore Millistak+ Pod深度过滤器的最大过滤面积为33 m2，可实现3-5,000 L的批次容量。Millipore Mobius FlexReady工艺设备支持更大的过滤面积（55 m2）。由于这些过滤器的洗涤需要非常大的缓冲液体积，因此可以用一次性PE衬里适当大小的保持罐。
在某些情况下，对大量澄清收获物进行交叉流过滤以减少后续纯化的体积；然而，碎片堆积延长了过滤过程的总时间。虽然这个过程不是无菌的，但使用一次性过滤器可以防止交叉污染的问题。
可用于处理重组蛋白和疫苗的一次性连续离心设备，如Ksep®。Ksep是一种封闭的连续流离心机，通过创建离心力和进料流力来工作。该系统提供了高效处理的好处，由于其低剪切、连续操作，不影响回收。
每种技术都有其优缺点；因此，测试每个选项，并根据特定方法和细胞类型选择合适的是推荐的。一次性解决方案的性能取决于USP性能、细胞密度、活性以及生物反应器肉汤中存在的细胞碎片程度。
3.7.2.纯化
对于蛋白质的分离和纯化，钢柱中装填了一种树脂（固定相），该树脂由多孔珠组成，这些多孔珠由多糖、矿物或与特定功能团结合的合成基质制成，利用不同的分离原理。与其他组分混合的蛋白质被缓慢地加载到柱上。一旦蛋白质与树脂结合，就使用适当pH的溶液和含有所需电解质的溶液洗脱树脂，以将目标蛋白质从混合物中分离出来。树脂被清洗和消毒以重复使用，这个过程可能涉及数十个或可能数百个循环。
现在有几家供应商提供用于ÄKTA机器的柱子（例如，GE Healthcare的ReadyToProcess™柱），以克服装填树脂和操作柱子所需的时间。GE Healthcare提供了广泛的树脂和定制树脂。这些是预先装填、预先确认和预先消毒的高性能生物加工柱。ReadyToProcess™色谱柱和一次性或一次性流路的使用消除了交叉污染的风险。ÄKTA ready系统具有卫生设计，非常适合在cGMP监管环境中使用。ÄKTA的简单程序和产品与批次之间的低停机时间，有助于提高经济性和生产力。其他预先装填的柱子，如Opus（Repligen）、GoPure（Life Technologies）。
ÄKTA系统旨在实现无缝可扩展性，提供与常规处理柱（如AxiChrom™和BPG™）相同的性能水平。ÄKTA系统目前提供一系列BioProcess™介质，有四种不同尺寸（1、2.5、10和20 L），这些柱子旨在纯化用于临床I和II期研究的生物制药。根据操作规模，它们也可用于全面制造和临床前研究。这些柱子可以用于广泛的色谱应用，以分离各种化合物，如蛋白质、内毒素、DNA、质粒、疫苗和病毒。
一次性色谱解决方案，如ÄKTA XL系统，提供预先装填的柱子、一次性流路、即插即用色谱柱和膜，以及预先消毒的过滤器和管路，以消除清洁验证。ÄKTA ready色谱系统旨在进行工艺放大和制造，并通过即用型、一次性流路运行，从而消除产品和批次之间的清洁验证。
从复杂混合物中纯化蛋白质是制药研究和生产中的关键过程。然而，基于颗粒基质的色谱法纯化蛋白质是一个漫长的过程，需要更长的分离时间。有几种配体可用（表4.2）。
膜吸附剂在单克隆抗体生产过程中去除高分子量污染物，如DNA和病毒方面具有优势。这种污染物分子不容易扩散到传统树脂中；因此，大多数依赖柱色谱的纯化步骤需要大幅度扩大柱子尺寸。超大柱子的水动力学优势提供了以比柱子大得多的流速运行膜吸附剂的机会，从而显著减少缓冲液消耗，并将整个过程时间缩短高达100倍。商业上使用的膜吸附剂有Mustang®（Pall）、Sartobind®（Sartorius）、ChromaSorb®（Millipore）和Adsept®（Natrix）。这些膜通常用于去除流程相关的杂质，如DNA和内毒素。
加速无缝抗体纯化过程是一种完全一次性的连续下游工艺，用于mAb生产，基于ÄKTA周期性逆流色谱（PCC）Protein-A、混合模式和阴离子交换树脂柱。在这个过程中，所有三个柱子同时循环。这些系统提供了一次性和连续处理的双重优势，同时提供了灵活性、操作简便和增加的容量。
在选择一次性耗材时，确保供应链的强大至关重要。确保正确的文件和测试可提取物和浸出物符合监管合规性。
一次性系统提供了极大的灵活性，可以在设施中处理多个产品；批次或产品之间的快速周转时间可以更快地发布产品。
3.7.3.病毒去除
病毒污染是所有源自人类或动物细胞系的生物技术产品的风险。蛋白质产品被细胞库的内源性病毒或人员意外病毒污染，可能具有深远的临床影响。三种互补的方法确保许可生物产品的病毒安全性：
• 对细胞系和所有原材料进行彻底检测，以确定是否存在病毒污染物，
• 评估下游加工清除传染性病毒的能力，
• 在适当步骤对产品进行检测，以确定是否存在污染病毒。
基于灭活、吸附和尺寸排除的方法组合是可用的。FDA要求通过两种方法证明病毒清除。灭活程序的例子包括使用溶剂和洗涤剂、化学处理、低pH或微波加热。基于吸附的方法包括色谱法，而通过机械或分子尺寸排除的病毒去除是通过正常（前向）和TFF方法执行的。
离子交换和蛋白A色谱法广泛用于去除病毒，并且已经与FDA合作进行了几项关键研究。然而，开发者负责证明任何病毒去除方法的适用性。膜过滤已在mAb生产过程中用于病毒清除多年。中空纤维膜柱甚至表面改性、亲水性膜，具有高空隙率和最小污染，能够减少高病毒滴度，是病毒清除的最新一次性选择。吸附性过滤器可以在纯化过程的最后与病毒过滤步骤一起使用。这些过滤器结合了尺寸排除和吸附的原理，通过疏水相互作用保留聚集体，同时提高病毒过滤效率。Sartorius、Pall和Millipore等几家制造商提供一次性病毒过滤解决方案，以去除大型包膜病毒和小非包膜病毒。纳米级过滤器通常用作病毒去除过滤器。这些过滤器最常见的病毒保留尺寸为20或50纳米。
4.过滤：超滤/透析和切向流过滤
过滤应用非常适合一次性处理。超滤和透析用于浓缩和更换溶液的缓冲液。在最终配方中，超滤和透析用于将活性药物成分转移到稳定环境中，并实现产品的适当浓度。根据柱洗脱物是否可以分级，可能需要处理高达300-5000 L的体积。通常使用30-kDa分子量截止的膜来保留抗体，并且过程中间体被浓缩和用5×体积洗涤。可用的膜面积高达3 m2，可以处理200 L/(h m2)的体积。有几种一次性系统（SciLog，Millipore）可用于有限的过滤面积（高达2.5 m2），但更大的系统（如一次性模块和泵）可能会取代现有可重复使用的系统，过滤面积为14 m2，因为在封闭系统中进行过滤步骤是合乎逻辑的。
一次性TFF模块可作为即用型盒式磁带用于TFF设置。这些系统提供快速的周转时间和更大的灵活性。一次性系统提供预组装单元，包括伽马辐照流路和传感器，从而减少了设置时间。预先消毒的预包装盒式磁带也是一次性系统的另一种选择。清洁TFF系统和盒式磁带是下游加工中的重要步骤，特别是对于多产品使用。在确保通量率得到良好维护的同时，最小化交叉污染风险至关重要。必须对清洁程序进行充分验证，包括针对每个产品的专用系统，以确保没有来自先前批次的产品残留。可以与现成的组件（包括阀门、传感器和2D液体袋）一起构建完全一次性的TFF系统。技术改进和一次性组件的集成可以使自动化一次性系统方便地应用于大规模生产。
4.1.一般过滤应用
通常，制药行业很少重复使用过滤器，除非是在非无菌剂型的大宗生产中使用钢网。在生物制药行业中使用的一次性过滤装置是最早使用的一次性系统形式，主要是因为与清洁它们相关的问题；它们的部件成本始终是合理的。
生物制药行业中正在使用许多过滤设计和机制。预过滤器通常是折叠式的，绕组过滤毛毡由熔喷随机纤维基质制成。这些过滤器用于从流体中去除较高量的污染物。预过滤器具有广泛的保留等级，可以针对所有必要的应用进行优化。预过滤器最常见的应用是保护膜过滤器，膜过滤器比预过滤器更紧、更具选择性。膜过滤器用于纯化或灭菌流体。这些过滤器需要进行完整性测试，以评估它们是否满足性能标准。可以使用微孔或超滤膜进行交叉流过滤。流体扫过膜层，因此保持其不被堵塞。这种过滤方法允许透析过滤或流体流的浓缩。
死端过滤是最简单的过滤操作方法之一。死端过滤使用将流体进料流垂直于过滤装置通过最小压力的原理，通常使用泵或过滤装置上方的压缩气体压力来施加。所有大于过滤介质平均孔径的污染物都被过滤材料截留，从而导致过滤装置通过堵塞其通道或孔洞而被堵塞。死端过滤的设置使用最少的配件，如管道/管路、罐和控制器。死端过滤器涉及由合成聚合物（如聚醚砜、聚酰胺、氰基丙烯酸酯和聚偏二氟乙烯）制成的微孔膜，广泛用于无菌处理。它们用于将培养基过滤到无菌袋和容器中，在细胞收获澄清期间减少生物负荷，色谱柱保护，以及纯化后的原料药最终过滤。这些过滤器通常连接到一次性袋子上，并通过伽马辐照预先消毒。
4.2.灌装-封口操作
灌装-封口是药物物质和药物产品的最终处理步骤，需要严格控制无菌操作，同时不损害无菌性和完整性，同时确保安全性和效率。因此，灌装-封口操作通常需要复杂的设备和技术。传统的灌装-封口设置使用固定系统，涉及需要广泛清洁和消毒、组装和拆卸的复杂组件。时间压力系统和活塞泵广泛用于计量和灌装操作。然而，这些系统需要组装和验证CIP和SIP，以确保最终产品满足无菌规格。对于这些关键过程使用一次性组件更有可能确保最终产品不受损害，同时减少交叉污染风险。此外，灌装-封口操作中的SUT可以减少批次之间的周转时间并增加灵活性，特别是对于多种产品的设施。
传统固定系统可以采用一次性解决方案。图4.3展示了一个带有安装硬件、硬管连接和有限操作灵活性的一次性灌装-封口设置。这种设置结合了Millipore在一次性流路管理方面的专业知识，以确保操作的无菌性和完整性。
成功实施一次性系统不仅仅是组装一次性组件。使用具有验证此类系统经验的供应商，并了解制造商的要求以集成和提供定制解决方案，确保兼容性并进行评估，对于一次性实施的成功和无菌保证至关重要。SUT的灵活性使其对于单产品和多产品灌装设施更加相关，从而由于安装、操作的便利性和消除CIP/SIP验证，提高了设施的效率和利用率。
4.3.安全
生物制剂制造商必须遵守监管要求。这包括，例如，确保供应商可靠，并且能够提供支持适用性（产品接触材料）、资格和验证一次性系统的必要文件，以支持最终用户的审核。最终用户必须有用户需求规范，并与多个供应商进行技术评估，以确定与他们的过程的适用性。一次性组件必须与预期用途的设备一起进行资格认证。此外，这些组件应包含在过程验证练习中。
一次性设备广泛使用塑料材料或弹性体系统，从过滤壳体到生物反应器的衬里。今天，也许一次性系统更广泛接受的最大障碍是围绕产品可能被塑料薄膜中的化学物质污染的争议。所有最终容器和封闭件应由不加速产品变质或以其他方式使其不适合预期使用的材料制成（生物制剂21CFR600.11(h)）。
监管要求涉及浸出物的毒性效应，以及基于浸出物对蛋白质药物的3D和4D结构的影响而对生物药物构成的风险。这些变化可以使药物更具免疫原性，如果不是效果较差的话，这些副作用因此对生物加工行业更为重要。浸出物是指在制造过程中从一次性加工设备迁移到药物产品各个组分的化学物质。可提取物是使用常见实验室溶剂在控制实验中从一次性组件中提取的化学实体（有机和无机）。它们代表最坏的情况，并预测在生物制药生产中可能遇到的浸出物类型。浸出物不仅特定于塑料，还特定于不锈钢中的化学物质。不锈钢在生物制药应用中常用，是316L级，是一种主要含有铁、镍和铬的合金，含有少量的锰和钒。不锈钢是金属浸出物的重要来源，特别是如果设备或罐的表面未经适当处理。主要的浸出物成分是铁、铬和镍。与经过钝化的不锈钢容器相比，在未钝化的不锈钢容器中储存后，在室温下，铁和镍等金属的浓度高出几倍，会渗入液体制剂中。
4.4.聚合物和添加剂
用于制造生物制药生产一次性加工设备的通常是聚合物，如塑料或弹性体（橡胶），而不是传统材料（金属或玻璃）。聚合物提供更多的多功能性，因为它们轻巧、灵活，并且比传统对应物更耐用。塑料和橡胶是一次性组件，它们的使用消除了清洁验证。添加剂也可以加入聚合物中以澄清玻璃或给标签或零件上色。使用添加剂（稳定剂）可以控制聚合物的降解。
当塑料树脂被加工时，通常被引入到挤出机中，在其中它被高温熔化，其稳定性受到其分子结构、聚合过程、残留催化剂的存在以及生产中使用的精整步骤的影响。挤出过程中的加工条件（例如，温度、剪切和在挤出机中的停留时间）可以显著影响聚合物的降解。暴露于过多热量或光线的最终使用条件（如户外应用或医疗实践中使用的灭菌技术）可能促进聚合物产品的过早失效，导致失去柔韧性或强度。如果不加以控制，该过程通常可能导致塑料部件完全失效。
在制造塑料中涉及的化学反应的复杂性影响了可提取物和浸出物的存在，使过程非常复杂和具有挑战性。在测试可提取物和浸出物时，可能渗入药物产品的是较少知名的次要化学物种，但这是无法预测的，因为它在更大程度上是产品特性的函数。所有聚合物和添加剂（稳定剂、填充剂和弹性体）的副产品都可能从聚合物中浸出到药物产品中。
尽管使用聚合物添加剂存在风险，但聚合物在一次性生物处理设备（以及所有医疗或制药应用）中的效用远远超过了与其使用相关的风险。通过三个步骤可以很好地管理这些风险：材料选择、实施适当的测试程序和与供应商合作。
4.5.材料选择
所使用的塑料类型应与其添加剂所需的物理和化学性质和兼容性相匹配。确保与药物产品的兼容性通常可以减少可能发生的材料浸出量。选择监管当局批准用于特定用途的聚合物和添加剂也很重要。这些化合物已经经过了相当多的分析和毒理学测试，通常可以获得这些化合物的充分信息。因此，大多数制造商可能会继续使用这些添加剂，并且用户不会在后期更改这些化合物的组成。使用聚合物和添加剂的艺术可能会继续存在，避免了变更控制步骤的需要，因为需要将重大的工艺变更报告回FDA。
商业供应的塑料薄膜是专有配方和排列；例如，Advanced Scientific生产由两种薄膜制成的袋子。与流体接触的薄膜由5.0-mm PE制成。外层覆盖物是一个五层7-mm共挤薄膜，提供屏障和耐用性。表4.3中展示了一个典型的测试报告。
4.6.测试
用于医疗和制药应用的聚合物应符合适当的USP指南，建议这些聚合物符合USP第VI类测试，如USP 88所记录。必须为所有直接接触药物的生物处理材料实施适当的可提取物和浸出物测试程序。Bio-Process Systems Alliance (https://bpsalliance.org/) 提供了进行此类测试的最佳实践指南，作为一个两部分的技术指南，评估与一次性加工设备相关的可提取物和浸出物的风险。该组织鼓励使用一次性系统并提供出色的支持和帮助；强烈鼓励读者访问该网站以获取最新信息，并参加他们的研讨会和会议，以跟上这一快速发展领域的最新进展。
对浸出物的测试一旦材料被确认后并不会结束。有必要有一个质量控制程序，而不仅仅是测试产品或设备。质量控制测试的水平将取决于风险容忍度。重组药物的制造涉及广泛的纯化步骤，可能会去除大部分这些浸出物。此外，用于蛋白质溶液的最终介质是水性的，许多浸出物在水中不溶，进一步降低了风险。最终包装组件也存在更大的风险；例如，用于包装最终剂量形式的橡胶塞比制造过程中暴露的一次性药物链中的任何其他组件更有可能对蛋白质配方造成风险。生物制剂制造商需要与供应商合作，以确保从产品安全的角度遵守监管要求。
颗粒物的DP应满足一个重要的规范或测试要求：可见和亚可见。通过过滤通常很好地控制药物产品与颗粒物的污染，并且在灌装期间进行视觉检查。一次性组件还必须在控制条件下制造，以减少颗粒物，并将最终产品中的颗粒物降至最低。
4.6.1.监管标准
没有特定的标准或指南引用一次性生物处理材料中的可提取物和浸出物。许多适用的参考资料是针对不考虑构造材料的处理材料和设备编写的。
美国和加拿大美国评估可提取物和浸出物的要求基础是在联邦法规（CFR）第21篇第211.65节中引入的，它指出：“设备应构造成不与组件、在制品材料或药物产品接触的表面，不会改变药物产品的安全性、身份、强度、质量或纯度，超出官方或其他既定要求。”这一规定适用于所有材料，包括金属、玻璃和塑料。可提取物和浸出物通常被视为添加剂，尽管浸出物也有可能与产品相互作用产生新的污染物。
美国FDA最终容器封闭系统的监管指南，虽然不是针对工艺接触材料编写的，但提供了关于最终产品测试的指导，可能涉及一次性工艺组件和系统的可提取物和浸出物。该指南指出了FDA认为对可提取物风险最高的药物产品类型和组件剂量形式的相互作用。一般来说，包装组件与剂量形式相互作用的可能性在注射剂量形式中最高，主要是因为在这种药物输送系统中允许的浸出物水平较低。
打算注射或吸入的药物将比口服或局部药物受到更高水平的监管关注。同样，液体剂量形式将比片剂受到更严重的监管关注，因为浸出物更容易迁移到液体中而不是固体中。
此外，药用级材料应符合或超过行业和监管标准和要求，例如在USP <87>和<88>中列出的那些。USP程序测试了与聚合物材料接触后哺乳动物细胞培养的生物活性。然而，它们不被认为是可提取物和浸出物的充分监管文件，因为许多毒理学指标没有评估，包括亚急性和慢性毒性，特别是致癌、生殖、发育、神经和免疫效应的评估。
5.在线监测
在线监测广泛用于上游流程，如温度、pH值、pCO2或pO2以及其他化学指标。这允许对进料、pH调节以及其他变化进行连续调整。然而，由于尚未建立监测和优化下游流程的最优参数以及改变下游处理的技术，因此尚未实现对下游流程的在线监测。
然而，近年来，人们非常重视创建在线监测的方法，以改变流程，修改产量、分子结构和产品的安全要素。目前，在线监测是发展最快的技术，但由于依赖在线收集的数据的技术性和监管复杂性，它的采用速度较慢。表4.4显示了在线监测如何影响下游处理，表4.5显示了现有技术的状态。
6.连续生产
连续生产是一种与传统批量生产相比具有较短停机时间的高度强化处理形式。因此，过程强化成为连续生产技术的先决条件，因为它可以增加层级，管理高介质体积、缓冲液，并且总体上强化过程，以从整个生产过程中获得更高的产量。
强化和连续生产的优势主要与提高生产力、减少对传统昂贵制造设施的投资需求有关，主要是因为企业可以协同使用一次性和强化设施，从而导致减少设施占地面积和成本。连续生产是提高药品质量和提高生产效率、降低药品价格的关键一步。
成功整合连续生产的关键驱动因素是连接制造的原则，其中单元流程在物理上甚至在数字上（自动化）都相互连接。这有助于使用完全集成的、连接的系统从开始到结束简化流程，该系统可以控制和监控产品质量。
提高产品质量的好处是，产品在可能造成降解或产生更多变体的一些单元操作中花费的时间更少，例如生物反应器流程和色谱分离，可以有效地解决产品及其其他变体（同种型）。连续生物制造过程的一个例子是将灌注生物反应器与多柱色谱捕获步骤相结合，然后进行流动式病毒灭活、多柱中间纯化、流动式膜吸附剂抛光步骤、连续病毒过滤和以连续模式操作的最终超滤步骤。连续捕获步骤获得了很多关注，主要是因为现代多柱色谱非常适合商业规模生产。
连续生产操作是减少废物和简化操作以提高效率的一步。虽然这个概念可能是相对较新的或在生物医药行业中使用不足，但其他下游操作，如超滤/透析过滤，也必须适应这个概念。尽管这是一个挑战，使用允许容易组装和操作闭式系统、最小化污染风险或减少生物负荷的无菌超滤胶囊，是一种解决方案。此外，结合使用自动化进行过程监测和数据采集以及一次性技术被认为是设计超滤/透析过滤操作以连续方法。单次通过TFF系统正在获得广泛关注，并且确实是有利的一次性替代品。然而，毫无疑问，对于商业规模和需要高产品浓度的配方，有更多的改进空间。
采用概念的第一步是认识到连续处理的需求，并概述批量流程如何转换或适应为连续流程。一开始可能不容易将批量操作转换为连续操作，因为必须理解并非所有批量流程都设计为连续的。批量处理涉及多个步骤，使用在线和离线分析来定义控制策略和支持流程。因此，可能最初只有少数步骤更容易转换，但只有在提高或保持生产力且不影响产品质量的情况下，才应进行任何更改。
采用连续生物制造的混合方法，即只有上游流程或部分下游流程以连续方式操作，是采用连续生产的更合理、更明智的步骤。这可以是将上游作为灌注操作与批量纯化相结合，或者具有恒定色谱捕获步骤的分批过程。
连续生产也得到了监管机构的越来越多的支持。FDA对连续单元操作的建议是确认生物医药处理正朝着促进新兴技术的未来迈进。需求是减少产品失败、提高质量和提高效率。这旨在进一步补充自动化、加强流程和有效利用资源（设施和设备）的努力。
6.1.连续色谱系统
连续色谱系统旨在进行连续处理，主要是当纯化阶段与上游生物反应器灌注或甚至是简单的分批过程相关联时。在批处理色谱模式中，每个纯化步骤使用一个单独的大柱子。在连续多柱设置中，多个较小的柱子在许多周期中串联操作，从而有效地同时管理这些柱子上的活动。当一个柱子上发生产品装载时，其他柱子可以准备或处于洗涤、洗脱和再生阶段。或者，装载步骤可以分散在两个串联设置的柱子上。
连续色谱在推进流程向临床开发和更有可能的商业规模生产方面引起了广泛兴趣，特别是得到了监管机构的支持和鼓励。连续色谱操作可以帮助最小化设施占地面积，使用较小的生物反应器（可以支持高生产力）、小到中等尺寸的柱子和减少的缓冲液消耗，再加上进行在线稀释的选项。多柱色谱有助于实现这些潜在好处，并提供了更好地利用蛋白A树脂容量的机会。分批过程可以连接到连续色谱捕获步骤，减少时间、成本，并可能改善产品质量。然而，由于硬件系统的复杂性增加和某些感知到的监管复杂性，需要解决的障碍仍然存在。
尽管如此，在决定连续色谱是否是最好的选择之前，会根据蛋白质的运营规模、属性和其他流程要求对每个项目进行详细审查。实施一个连续的端到端系统可能不是立即可能的，从批处理转换到连续处理并不总是容易的。然而，新兴技术如直通处理（STP）、模拟移动床（SMB）和周期性逆流色谱（PCC）可以作为传统批处理的替代方案，作为连续或半连续处理选项。
6.1.1.直通处理
在STP中，两个或更多的色谱步骤串联连接，通过柱子间的过程条件的在线调整，以确保在下一步中优化装载条件。这一步消除了传统批处理过程中中间调节步骤的需要，几乎不需要中间暂存罐，提高了效率，设备要求最少（图4.4）。
6.1.2.周期性逆流色谱
PCC是一种多步骤方法，旨在最大限度地利用色谱树脂的容量（从而减少树脂体积）并最小化流程时间。PCC使用三个或更多的柱色谱步骤来完成资本化树脂容量。柱1装载至60%–80%突破，之后它被断开进行洗涤和洗脱，然后进行平衡步骤。然后将流程切换到柱2，它也装载至突破，之后它被断开进行洗涤、洗脱和平衡步骤。相同的操作序列对柱3执行。此时，柱1准备重新上线重复这些步骤，从而创建连续处理。这增加了可用树脂的利用率，同时允许更小的设备占地面积和有效的时间管理。
6.1.3.模拟移动床色谱
SMB色谱已在石油化工和食品工业中使用。它允许流程相对于批处理方法实现高生产力，因为有效地利用了分离所需的固定和流动相。
模拟移动床色谱的基本概念是使用多个较小的柱子，其中包含固定吸附剂（床），并将床朝流体（进料、洗脱剂和产品）的相反方向移动，以实现逆流流动。“模拟移动”通常通过在柱子之间的多端口阀执行，以便输入和输出流体流（进料、洗脱剂和产品）可以从柱子到柱子在流体流动方向上定期切换。阀门的排列和控制有助于策划样品和溶剂的移动，从而允许不同的分离阶段同时由不同的柱子作为连续周期进行。
7.连续生产
作为批处理执行的重组蛋白技术符合行业标准。然而，也可以在容器中生产蛋白质，其中产量被连续移除，前提是蛋白质分泌到培养基中。这个过程有助于提高不稳定蛋白质的产量，并防止不一致的翻译后修饰，同时保持细胞在更高的活性，这是一个关键因素。除了材料成本外，它还减少了测试的需要，增加了显著的成本和时间节省（图4.4和4.5）。
CM流程的追求已经在研究多年；然而，直到2023年3月，FDA发布了其第一个关于CM的指南，解决了在化学和生物药物的CM的创建、安装、操作和生命周期管理期间出现的科学和法律问题。图4.5显示了用于治疗蛋白的CM生产流程图。FDA还确定了控制CM的其他指南。
该设置包括与灌注培养系统兼容的生物反应器、连续捕获色谱、病毒过滤、病毒灭活以及通过TFF色谱柱进行缓冲液交换和浓缩等单元操作。每个单元操作与相邻的单元操作、 surge line 或连接单元操作的罐连接。分支点D1和PAT（T1）位于色谱之后（色谱#1）。使用 surge line 或罐允许连续操作适应质量流量或流程动态的差异。单元操作可以根据需要集成。
CM流程在涉及两个或更多单元操作的集成系统中，连续地将输入材料输入、在过程中转换材料，并同时从制造过程中移除输出材料，无论其性质如何。CM生产的批量大小定义为输出材料的数量、输入材料的数量和运行时间（在定义的质量流量下的最小或最大）。在CM流程中，来自同一细胞库的一个或多个小瓶的单一解冻可能导致单一或多个收获。用于生产指定药物批次的细胞库小瓶的数量或范围应该被定义。细胞库小瓶应该可以追溯到输出的药物批次。FDA指南还详细说明了CM流程的电子通用技术文件（eCTD）提交应该如何管理，使生物仿制药开发商能够正确规划流程变更。这项技术可以应用于分泌或使用E. coli使分泌的蛋白质（表4.6）。
化学和生物产品的CM长期以来一直是优化制造成本的目标；然而，cGMP合规性问题一直将其推迟，直到2023年3月，FDA发布了第一个指南，建议如何开发和采用CM，特别是生物产品。CM需要一个灌注系统，它可以被设计为使用E. coli，这将是一个比CHO细胞更好的选择，因为批处理周期要短得多，通常是几个小时，而不是CHO细胞的几周。在E. coli中，蛋白质可以被定向到细胞质、周质空间或直接分泌到培养基中，提供了几种选择，利用每个细胞区室和产生的蛋白质的特点。
CM流程的追求已经在研究多年。虽然FDA尚未批准在连续系统中生产的生物产品，但它预计会有很大兴趣。因此，在2023年3月，FDA发布了其第一个关于CM的指南，解决了在设计、安装、操作和生命周期管理化学和生物药物的CM期间出现的科学和监管问题，包括eCTD提交结构。这一指南为连续系统而非批处理系统铺平了道路，这将显著影响开发和生产成本以及蛋白质的稳定性，并导致生物反应器尺寸的大幅度减小。FDA还确定了控制CM的其他指南。
作为批处理执行的重组蛋白技术是行业标准。然而，也可以在容器中生产蛋白质，其中产量被连续移除，前提是蛋白质分泌到培养基中。它有助于提高不稳定蛋白质的产量并防止不一致的翻译后修饰，同时保持细胞在更高的活性，这是一个关键因素。除了材料成本外，它还减少了测试的需要，增加了显著的成本和时间节省。
8.总结
几项监管进步包括3D打印固体剂型、连续批处理制造以及在线过程控制取代放行测试。人工智能和机器学习的作用将深深嵌入所有制造操作中。一旦监管机构开始批准通过SUT制造的产品，SUT最终将取代硬连线系统；更具体地说，初创企业将采用这种方法。
