首先对于降低相关效应功能的工程化改造，研究者从INN(International Nonproprietary Names)中选出符合条件的工程化改造，包括野生型IgG1, IgG2, IgG3 ,IgG4和野生型进行234S/235T/236 R (“STR”)突变的对照，总共77个变体，以靶向CD20的抗体为基础进行研究（在CD20单抗的基础上进行各种突变）。
这些工程化改造中，除了野生型IgG2或IgG4，出现在INN列表中最频繁的变体是IgG1 L234A/L235A（28次）、IgG4 F234A/L235A（17次）、IgG1 N297G（16次）、IgG1 N297A（12次）、IgG1 L234A/L235A/P329G（10次）、IgG4 L235E（8次）、IgG1 L234A/L235A/G237A（7次）和IgG1 L234F/L235E/P331S（7次）。这105个“最流行”的工程化改造占所有改造的62%。
在消除相关效应功能效果方面，三重突变234S/235T/236R（STR），无论将其引入IgG1、IgG2、IgG3还是IgG4，都能够完全消除与人类Fcγ受体的结合。在235、238、265、267、273、297、299、322、328、329、330、331这些位置上的单点突变不足以消除FcγR结合，并且只有F296A/N297Q（即非糖基化）在IgG2或杂交IgG2/1的背景下，两个突变消除了与所有受体的结合。除了STR，唯一完全消除FcγR结合的IgG1变体是F233Δ/L234Δ/L235Δ。还有两个IgG2和两个IgG4变体在SPR实验中无法检测到结合。然而，根据INN列表，这些变体都没有在临床上广泛使用。相比之下，至少出现在七个或更多INNs中的“最流行”变体，并且基于233到237区域（LALA或类似）或297（非糖基化）的突变，都能检测到其和两个或更多受体的结合。
在细胞层面的效用功能验证，包括ADCP和ADCC。在“最流行”的工程化中（在INNs中超过7个或者以上的突变），只有L234A/L235A/P329G（LALAPG）在所有基于细胞的实验中相关效应功能都为阴性。无糖基化变体N297G和N297A与FcγRI结合时显示出高水平的ADCP活性，而其他变体则与两个或更多受体结合时显示出显著的ADCP活性。除了LALAPG之外，还有一些“不太流行”的工程化改造在所有基于细胞的ADCP和ADCC实验中相关效应功能都完全消失，如所有四种Ig亚类背景下的STR工程化改造，以及4个IgG1工程化改造组合，2个IgG2工程化改造，2个IgG4工程化改造和IgG2/1工程化改造。
在稳定性方面，野生型IgG1的熔解起始温度（Ton）为63.1°C，熔点（Tm）为73.2°C。Ton的平均拟合误差为±0.4°C，Tm为±0.2°C。如果测试样本的Ton低于61.9°C（即低于拟合误差的三倍以上），则认为显著降低。同样，如果Tm低于72.6°C，则认为显著降低。
对于大多数工程化改造，有两个温度转变，但是对于某些改造，有三个温度转变，但为了比较不同工程化改造对抗体稳定性的影响，该研究比较Ton和第一个转变点（Tm）。野生型IgG2、IgG3和IgG4的熔解温度都显著低于IgG1。在51个IgG1工程化改造中，有30个与野生型相比，Ton和/或Tm显著降低。其中受影响最严重的是N297或T299去糖基化改造。其他与热稳定性降低相关的改造包括L234F、L235E、P238S、D265A、V273E、K322A、L328R和P329G。相比之下，STR突变234S/235T/236R相对于所有四个亚类的相应野生型对照，Ton和Tm都增加了大约2-4°C。
而对于增强相关效应的工程化改造，相对来说主要集中在IgG1亚型上，这也比较容易理解，因为IgG1亚型并IgG2和IgG4有更强的ADCC等相关活性，而且比IgG3稳定性更强，因此对于增强ADCC的相关研究主要还是集中在IgG1亚型上，根据研究者统计，目前INN中多数还是去岩藻糖的改造。
与之前的研究一致，尽管野生型IgG3与所有重组Fc受体强烈结合，但在所有ADCP和ADCC实验中活性水平都很低。在增强ADCP活性方面，本研究中的所有工程化改造都没有增强ADCP的能力，即与FcγRI结合能力没有增强，有些甚至显著降低。大多数（14/22）工程化改造与FcγRIIIa的两个等位基因的结合更强，即增强了ADCC，特别是对于通常与野生型IgG1结合活性较低的158F等位基因，增强效果更为明显。对于FcγRII的结合，相对来说比较复杂，有7个突变没有增强活性，12个变体只增强了一种亚型或一个等位基因的活性，而3个变体增强了所有三种形式的活性。而在CDC活性方面，测试的工程化改造影响相对较小，基本上都在10倍以内。（下表是IgG1野生型的EC50与突变抗体的EC50的比值，数字也高，说明突变后EC50越低，增强效果越明显）。
在稳定性方面，不同于上述ADCC相关减弱效应的突变，增强ADCC的很多改变都在一定程度上影响抗体的稳定性（下表中Ton值和Tm值相较于野生型都有一定程度的下降）。所以在进行ADCC效应增强时一定要注意抗体可开发性方面的考虑，这些是部分研究会将相关突变和其它突变进行组合，从而增强抗体的稳定性。
总结
无论是降低ADCC还是增强ADCC等相关效应的工程化改造有很多，但是之前的研究并没有将多数改造进行平行比较，特别是在增强能力和改造后成药性方面。这两篇文章以CD20抗体为基础，系统的比较了各种工程化改造对ADCC等相关效应的影响，同时也比较了这些突变对抗体成药性方面的影响。当然除了相关效应工程化改造，还有增强半衰期的改造，本文章没有涉及，此外这里的相关研究也没有涉及相关突变组合的影响。
2、DOI: 10.1080/19420862.2024.2402701
