1.引言
生物仿制药候选物的分析评估是确定生物相似性的主要决定因素。图5.1显示了美国食品药品监督管理局（FDA）最初的金字塔分类，该分类将开发层次进行了分类；2020年，FDA修改了法规，以显示分析评估的更大作用，但在2023年，美国国会修改了BPCIA，删除了“动物毒理学”一词，并将其归入非临床测试。2023年，FDA还同意，对于表现出药效学参数的分子，不需要在患者中进行疗效测试（见图5.1）。
分析仪器的进步和对蛋白质结构和功能关系的更好理解，已经使分析评估成为比较参照产品的关键质量属性的最强有力的工具。这些质量属性来自于产品和过程，现在可以用比以往敏感数百万倍的方法进行识别和分析。与产品相关的属性涉及固有的表达特性，通常难以改变或不可能改变。另一方面，与过程相关的属性与整个制造过程有关，从上游和下游到填充和完成阶段。这些标准由制造过程决定，成为放行规范的一部分，确保合规性。定义这些质量属性的接受标准可以利用从测试参照产品中获得的要求。这些标准可能源于传统值，既定的注射产品实践，或两者的混合。然而，使用药典规格时会出现限制。FDA禁止其用于药物物质（DS）或药物产品（DP），尽管它们在药典方法中的适用性，这些方法只需要验证而不需要验证。蛋白质通常可以通过三种主要方式表现出差异：（1）主要氨基酸序列；（2）氨基酸的修饰，如糖基化或其他侧链修饰；以及（3）包括蛋白质折叠和蛋白质间相互作用的高阶结构。氨基酸的改变可能会引入异质性，给控制带来挑战。环境因素如光线、温度、湿度、包装材料、容器封闭系统和输送装置材料可能会影响蛋白质的修饰和高阶结构。此外，与过程和产品相关的杂质可能会增加对蛋白质产品的免疫反应的可能性和严重性。某些辅料可能会阻碍对蛋白质产品的全面表征。监管指南概述了分析属性的评估，这些属性需要证明提出的生物仿制药的资格，以便提交市场申请。虽然这些指南专门针对治疗性蛋白产品，但基础科学原理可以扩展到其他蛋白质产品的发展，包括体内蛋白质诊断产品。如果参照产品缺乏足够的表征，以获得相关的分析属性，开发者可能无法提交市场授权申请。作为全面CMC数据提交的一部分，申请必须包括分析研究，展示提出的生物仿制药与参照产品的相似性。比较分析评估的理由应该清楚地阐述，考虑到参照产品的特性、已知的作用机制和功能。物理化学和功能特性的研究需要充分建立相关的质量属性，这些属性包括定义产品的关键元素：其身份、数量、安全性、纯度和效力。通过分析评估功能和物理化学特性的分析研究结果——如高阶结构、翻译后修饰、杂质和降解概况——开发者可以为后续动物和临床研究中验证生物相似性的目标方法建立科学上合理的基础。采用有意义的指纹分析算法，通过高度敏感的正交方法涵盖各种产品属性及其组合，可以帮助比较提出的生物仿制药与参照产品之间的质量属性差异。根据国际协调理事会（ICH）Q8（R2），利用增强的制造科学方法可以促进生产过程更好地与参照产品（RP）的属性对齐。请参阅ICH行业指南文件Q8（R2）药物开发（2009年11月）、Q9质量风险管理（2006年6月）、Q10药物质量体系（2009年4月）和Q11药物物质的开发和制造（2012年11月），以获取有关先进制造方法的指导。这种战略方法可以进一步量化两个分子之间的总体相似性，并可能为后续动物和临床研究中更有针对性和选择性的方法提供额外的理由。
2.测试计划
必须清楚地概述提出的生物仿制药与参照产品之间的任何差异的描述和讨论——无论是有意的还是通过多个生产批次的全面分析表征观察到的。这次讨论应该包括从产品表征中识别和比较相关的质量属性。如有必要，应该评估并支持观察到的结构和功能差异对临床的潜在影响，并由动物或临床研究支持。
3.变异来源
分析关键质量属性需要全面了解提出的生物仿制药与参照产品之间的变异来源。生物仿制药开发的一个主要目标是在可行的情况下，最小化提出的生物仿制药与RP之间的差异。这方面的一些努力包括修改表达系统、上游和下游过程、配方和制造过程。
3.1.表达系统
治疗性蛋白产品可以在各种系统中创建：微生物细胞（原核或真核）、细胞系（如哺乳动物、禽类、昆虫或植物）或来自动物或植物的组织。预计提出的生物仿制药的表达结构将与其参照产品具有相同的主要氨基酸序列。然而，次要修饰，如N-或C-末端截断（例如，单克隆抗体C末端赖氨酸的异质性）预计不会改变产品性能。这些修饰可能是合理的，应该由开发者解释。应该仔细考虑所选表达系统（即宿主细胞和表达结构）与参照产品之间的任何潜在差异。这是因为所选的表达系统将影响可能存在于蛋白质产品中的与过程和产品相关的物质、杂质和污染物（包括可能的外来因子）的类型。例如，表达系统可以显著影响提出的生物仿制药中翻译后和翻译后修饰的类型和程度，可能会引入额外的不确定性，以证明提出的生物仿制药是参照产品的生物仿制药。尽可能最大程度地减少提出的生物仿制药与其参照产品的表达系统之间的差异，可以增加生产生物仿制药蛋白产品的可能性。将逐个评估使用不同的表达系统。然而，开发者应该考虑验证替代表达系统所需的额外测试负担。在市场上，监管应该更加强调证明产品的安全性。
3.2.生产过程
在产品开发过程中，必须建立对提出的生物仿制药制造过程所有阶段的全面了解。作为科学要求，从工艺开发过程中收集的信息得出的表征测试、过程控制和规格必须针对提出的生物仿制药及其制造过程进行定制。先进的药物开发方法，结合质量风险管理和高效的质量体系，将有助于一致地生产高质量产品。有关制造科学中增强方法的指导，请参考ICH行业指南Q8(R2)药物开发（2009年11月）、Q9质量风险管理（2006年6月）、Q10药物质量体系（2009年4月）和Q11药物物质的开发和制造（2012年11月）。开发人员在最初的比较分析评估之后或在完成旨在支持申请的临床研究后考虑制造变更，必须建立变更前后提出的生物仿制药之间的可比性。根据变更的性质和范围，可能需要额外的研究。比较分析研究应包括在临床研究中使用的足够数量的提出的生物仿制药和提出的商业过程，如果临床研究材料所用的过程与不同。制造过程可以修改蛋白质产品，影响其安全性和有效性。例如，用于蛋白质生产的生物系统的变化可能导致不同的翻译后修饰，影响最终产品的安全性和有效性。因此，当改变市场上蛋白质产品的制造过程时，申请人必须评估变更的影响。这种评估需要通过适当的分析测试、功能测定，以及在某些情况下，动物和临床研究，证明修改不会对产品的安全性或有效性产生负面影响。ICH行业指南Q5E，标题为“其制造过程发生变化的生物技术/生物产品的可比性”，概述了评估制造变更的科学原则。与评估同一制造商在制造变更前后产品的可比性相比，建立提出的生物仿制药与参照产品的生物相似性通常涉及更大的复杂性。这种复杂性源于制造商对其制造过程的广泛了解，包括既定的控制和接受参数。相比之下，提出的生物仿制药的制造商可能会采用与参照产品不同的制造过程（例如，不同的细胞系、原材料、设备、过程、控制和标准）。此外，他们缺乏对参照产品制造过程的直接了解。因此，尽管ICH Q5E中的一些科学原理可能适用于证明生物相似性，但监管机构期望需要更多的数据和信息来建立生物相似性，而不是在制造商的制造变更后证明可比性。此外，ICH Q5E不强制使用参照产品，使其不适合最初建立生物相似性。
3.3.结构属性
结构属性，如一级、二级和三级结构，由重组表达引擎的性质决定。虽然蛋白质的基因序列决定了其氨基酸序列，但在内质网（ER）中的质量控制过程中发生的翻译后修饰以及通过高尔基体的传递决定了其最终结构和功能。这些特定于物种和细胞的过程，在开发用于生成重组生物治疗剂的生产平台时，给生物制药行业带来了挑战。蛋白质和糖蛋白（P/GP）在体内和体外都容易受到化学修饰的影响。身体容忍自身分子的分子形式，但非自身变体可能触发免疫反应，导致抗药物抗体（ADA）的产生。聚集形式可能表现出增加的免疫原性，促使努力避免或消除它们。单克隆抗体治疗剂（mAbs）是一个独特的案例，因为它们旨在结合目标，形成免疫复合物（ICs），这代表了一种特定的聚集形式。具有抗原呈递能力的吞噬细胞可能会消除这种ICs。这些因素使得通过严格排除药物产品中的聚集体来减轻mAbs的免疫原性变得具有挑战性。治疗性抗体具有各种质量属性，其中FcRn结合和相关结构对产品的药代动力学概况有显著影响。其他属性，如抗原结合、糖结构和等电点，也可能影响药代动力学概况。然而，这些属性并未包含在放行规格中；它们被测试一次以确认相似性。由于测试是与参照产品一起进行的，因此消除了方法验证的需要。建议采用等效性边际方法，需要6-10批（见下文），以建立相似性。
3.4.功能属性
在治疗性抗体的关键质量属性中，FcRn结合和相关结构显著影响产品的药代动力学概况。其他属性，如抗原结合、糖结构和等电点，也可能影响药代动力学概况。然而，这些属性并未包含在放行规格中；它们被测试一次以确认相似性。由于测试是与参照产品一起进行的，因此消除了方法验证的需要。建议采用等效性边际方法，需要6-10批（见下文），以建立相似性。
3.5.物理化学属性
当开发人员设计和进行表征研究时，解决ICH Q6B中讨论的所需产品（及其变体）的概念至关重要。了解提出的生物仿制药与参照产品之间的异质性，包括糖基化水平、异构体变异性和翻译后修饰，是必要的。请参阅ICH行业指南Q6B规范：生物技术/生物产品的测试程序和接受标准（1999年8月）。分析方法评估特定的物理化学蛋白质特性。这些方法在科学文献、监管指南和药典汇编等出版物中概述，通常提供多方面的信息。选择适当的分析测试方法取决于蛋白质的性质、对结构的了解、参照产品和提出的生物仿制药的异质性，以及产品性能的关键特征。附录1提供了提出的生物仿制药开发人员使用的测试方法的代表性示例，供提交给FDA和EMA的申请参考。
3.5.1.聚集体
尽管聚集体通常被认为具有免疫原性，但对于单克隆抗体，建立所有批次必须落入的范围是必要的。建议采用等效性边际方法来确定这一放行规格属性，需要多个批次以建立可靠的质量范围。如果提出的生物仿制药显示出较低的聚集体，在等效性边际的低端潜在失败是可以接受的。然而，重要的是要注意，参照产品批次经过时间和运输测试，可能会增加总聚集体。仅因较低的聚集体，提出的生物仿制药不会被视为“生物改良药”。
3.5.2.杂质
杂质分为与产品相关或与过程相关的。活性或非活性的，与产品相关的杂质必须根据现有的文献数据进行分类。任何不在参照产品中的杂质，无论其来源如何，都应该完全表征，因为可能具有免疫原性。开发人员应该优先通过过程变化去除这些杂质，而不是证明其安全性，这可能需要额外的非临床或临床研究。表征、识别和量化提出的生物仿制药和参照产品中的与产品相关的杂质，尽可能，是必要的。如果比较分析显示提出的生物仿制药和参照产品之间有相似水平的可比产品相关杂质，可能不需要额外的药理学和毒理学研究来表征特定杂质的生物效应。然而，如果制造过程在提出的生物仿制药中引入了与参照产品不同的或更高水平的杂质，可能需要进一步的药理学、毒理学或其他研究。术语“与产品相关的”和“与过程相关的”杂质与其在ICH Q6B中的使用和含义一致。
依靠纯化过程来去除杂质比建立它们的临床前测试计划更为可取。（参见2012年5月ICH指南S6(R1)生物技术衍生药物的临床前安全评估，第2页。）
源自细胞基质（如宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白）、细胞培养成分（如抗生素和培养基成分）以及下游加工步骤（如试剂、残留溶剂、可沥滤物、内毒素和生物负荷）的过程相关杂质需要评估。在提出的生物仿制药中预期的过程相关杂质并不期望与参照产品中发现的杂质相匹配，因此不包括在比较分析评估中。选定的分析程序必须能够充分检测、识别和准确定量显著水平的杂质。作为参考，请参见1997年5月ICH指南Q2B分析程序验证：方法学。具体来说，检测宿主细胞蛋白的免疫学方法取决于所用的测定试剂和细胞基质。这些测定需要使用产品细胞基质和正交方法进行验证，以确保精确度和灵敏度。
与任何生物产品一样，确保提出的生物仿制药在意外代理或内源性病毒污染方面的安全性，需要筛选关键原材料，并确认在制造过程中实现的稳健的病毒清除和灭活。参见1998年9月ICH指南Q5A源自人类或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全评估。
3.5.3.宿主细胞蛋白和残留DNA
在开发新的生物产品时，确定HCP（宿主细胞蛋白）和残留DNA的可接受限度涉及证明降低这一不利属性的可行性，评估特定产品的相对安全风险，并监测这些属性。HCP和残留DNA都依赖于有机体菌株，因此即使开发者使用相同的表达系统，复制原始菌株也是不可能的。由于HCP和残留DNA是菌株特异性的，因此直接比较提出的生物仿制药的相对安全性只通过全面安全研究评估这些属性才是可行的。监管机构需要对HCP和残留DNA进行关键分析，承认这些可能与原始产品中的不同。还建议使用2D SDS分辨率来解决测试和参照产品中的这些成分。声称测试和原始产品中的HCP和残留DNA之间的相似性是具有挑战性的。虽然确实，提出的生物仿制药中的HCP和残留DNA可能与参照产品中的不匹配，但如果使用相同的表达系统（例如，大肠杆菌），安全性很可能与这些成分的数量成比例，尽管任何特定活性与特定成分相关。因此，测试产品通过等效性范围方法证明非劣性是可行的。
3.6.批间变异性
观察到的批间变异性可能源于制造条件和分析测定的差异。导致蛋白质产品生产中批次间变异的因素包括特定原材料的来源（如生长介质、树脂或分离材料）和不同的制造场所。因此，在比较分析评估中，充分表征参照产品和提出的生物仿制药的批间变异性至关重要。
在某些情况下，可能需要修改提出的生物仿制药的制造过程，以解决比较分析评估中观察到的差异。应该提供证明通过制造变化解决观察到的差异的数据，以及证明其他质量属性未受到显著影响的证据。如果其他属性受到制造变化的影响，数据应该说明评估和减轻变化影响的评估。
3.7.与产品或过程相关的物质
分析科学的进步——无论是物理化学还是生物学——在物理化学和生物学属性方面显著增强了各种蛋白质产品的表征。这些分析程序显著提高了识别和表征预期产品以及与产品及其制造过程相关的产品相关物质和杂质的能力。
“产品相关物质”和“产品和过程相关杂质”的术语与ICH Q6B指南中概述的用途和意义一致。产品相关物质是指至少具有活性目标药物物质80%活性的目标物质变体。杂质可以是活性的或非活性的。
必须识别、适当表征、定量并比较多个批次的提出的生物仿制药和参照产品中的产品相关杂质和物质。这种比较，在可行和相关范围内，构成了评估对产品安全性、纯度和效力潜在影响的关键部分。
3.8.方法灵敏度
监管机构提倡使用最新技术。开发者应该使用具有足够灵敏度和特异性的分析方法来辨别提出的生物仿制药和参照产品之间的差异。
制造科学和生产方法的进步增加了证明提出的生物仿制药和参照产品之间相似性的可能性，特别是通过针对参照产品的物理化学和功能属性。然而，尽管分析科学取得了进步，可能会检测到蛋白质产品之间的一些差异，这些差异可能与临床无关。尽管如此，使用高度敏感的方法证明相似性可以增加信心并减少额外研究的需要。
尽管分析技术有所改进，但当前方法可能无法识别两种蛋白质产品之间的所有相关结构和功能差异。了解每种分析方法的局限性对于开发者来说至关重要，以识别残留的不确定性并计划后续测试。此外，可能对产品结构属性与其临床性能的相关性了解不完全。
与常规质量控制测定不同，用于表征产品的测试不一定需要验证。然而，它们应该是科学合理的，适合其预期目的，并能够产生可重复和可靠的结果。选择这些测试应该考虑蛋白质产品的特性，包括已知和潜在的杂质。应该包括有关方法区分提出的生物仿制药和参照产品之间相关差异的能力的信息。这些方法应该表现出适当的灵敏度和特异性，以提供对两种产品之间相似性的有意义的见解。
3.9.比较测试
与为新药建立特性而进行的单独测试不同，生物仿制药的开发不需要进行此类独立的安全性或有效性测试。相反，所有测试都是比较性的，强调在建立测试方法、协议及其比较范围时的一个关键区别，而不是表征。
比较分析数据是开发提出的生物仿制药的基石，影响着决定支持证明生物相似性所需的动物和临床数据的类型和数量。应该进行全面和强大的比较物理化学和功能研究，可能包括生物测定、结合测定和酶动力学，以评估提出的生物仿制药与参照产品。
全面的比较分析评估在很大程度上依赖于最新分析测定的能力。这些测定确定各种因素，如蛋白质的分子量、复杂性（包括高阶结构和翻译后修饰）、异质性程度、功能属性、杂质概况和降解概况，所有这些都表明稳定性。开发者必须详细说明在这些分析评估中使用的测定方法的能力和局限性。替代分析研究方法提供了对质量属性的不同视角，而不会重复测试同一属性或使用不提供独特视角的方法。在进行比较分析评估时，基于正交测试而完全忽略失败的测试是不可取的。
在进行比较分析评估时，风险排名和数据分析评估许多属性，通常使用多个正交测定。监管机构评估所有分析数据。在特定测定中未达到特定标准并不一定否定相似性的证明。如果在比较分析评估期间（即使在风险排名中未包含的组件中）产品之间出现差异，开发者可以提供额外的科学信息（如风险评估和补充数据）以及为什么这些差异不会阻碍证明产品之间相似性的合理化。
3.10.并行测试
对于提出的生物仿制药，开发者应通过对适当数量的提出的生物仿制药和参照产品的批次进行并行分析来进行比较测试。在可用和适当的情况下，还应包括与内部参照标准的相关属性（例如，效力）的比较。评估参照产品和提出的生物仿制药的多个批次允许估计不同批次之间的变异性。所需的批次数量可能因情况而异，开发者应为他们的选择提供科学依据。
并行测试的重点在于解决测试方法的变异性，特别是那些不能完全验证的方法。同时进行测试有助于解决测试方法可靠性的大部分差异。因此，任何关于参照产品质量属性的已发布数据都不能用于与提出的生物仿制药进行比较。类似地，使用参照标准来匹配提出的生物仿制药和参照产品之间的属性是无效的。即使对于分子量、序列或其他固定属性等已建立的属性，这些限制也适用。
3.11.异质性
治疗性蛋白在生物系统中产生，自然会在某些质量属性上表现出变异性。这种变异性可能来自不同的来源，并且显著影响蛋白质产品的预期临床表现。在DNA编码蛋白质序列的复制过程中可能发生错误，以及在翻译过程中氨基酸的错误掺入，尽管这些错误通常保持在低水平。此外，大多数蛋白质产品会经历翻译后修饰，可以通过附加额外的生化基团（如磷酸盐、脂质、碳水化合物）进行修饰，翻译后进行蛋白水解裂解，改变氨基酸的化学性质（例如，甲酰化），或通过许多其他机制。这些修饰可能源于细胞培养期间的细胞内活动或蛋白质的有意修饰（例如，聚乙二醇化）。此外，制造过程操作可能导致其他翻译后修饰；例如，由于产品暴露于还原糖，可能发生糖基化。某些存储条件也可能促进或阻碍特定的降解途径，如氧化、脱酰胺或聚集。这些不同的产品相关变体有可能改变表达的重组蛋白的生物特性。因此，至关重要的是在比较分析表征研究中包括识别和确定这些变体的相对水平。
3.12.结构确认
蛋白质的三维构象显著影响其生物功能。由于其大小和蛋白质α碳的旋转特性等因素，蛋白质通常显示出复杂的三维构象（三级结构，偶尔还有四级结构）。这种固有的灵活性允许蛋白质构象随时间发生动态但微妙的变化，其中一些可能对功能活动是必要的。这些旋转通常依赖于低能相互作用，如氢键和范德华力，这些相互作用对环境条件非常敏感。目前的分析技术能够评估许多蛋白质的三维结构。使用多种相关、尖端的方法可以帮助定义三级蛋白质结构，以及在不同程度上定义四级结构，从而有助于支持生物相似性的信息。然而，使用当前的物理化学分析技术精确定义蛋白质的三维构象可能存在挑战。提出的生物仿制药与参照产品之间的任何高阶结构差异都应仔细检查其对蛋白质功能和稳定性的潜在影响。因此，功能测定是评估高阶结构完整性的重要工具。
3.13.接受标准
通过最初对参照产品和提出的生物仿制药进行探索性测试来建立每个测试的接受标准。这种方法导致定义规格和接受标准。一个正式的研究，需要通过统计计算确定特定数量的批次，比较提出的生物仿制药与参照产品。机构鼓励开发者与他们协商，以确保评估适当数量的批次。必须确定用于比较分析研究的参照产品的具体批次，包括有效期、分析时间框架以及它们在非临床或临床研究中的使用。这些信息证实了接受标准，确保产品一致性，并支持提出的生物仿制药与参照产品之间的比较分析评估。
然而，接受标准不应仅依赖于参照产品的观察到的产品属性范围。相反，它们应该基于全面的分析数据证据。某些产品属性相互作用，共同影响产品的安全性、纯度和效力概况。因此，在建立规格时应考虑它们的潜在相互作用。例如，在某些糖蛋白中，四天线和N-乙酰葡萄糖胺重复单元的含量和分布可以共同影响体内效力，它们的评估不应独立进行。
此外，从用于非临床和临床研究的批次获得的数据以及有关属性-药物产品性能关系的相关信息，可以帮助建立接受标准。有关更多详细信息，请参阅2009年11月ICH行业指南Q8(R2)药物开发。
3.14.正交测试
为了全面评估物理化学属性或生物活性，通常需要多种分析程序来评估相同的质量属性。使用不同的物理化学或生物学原理来评估同一属性的方法特别有价值，因为它们提供了支持该属性的独立数据（例如，使用正交方法评估聚集）。按顺序使用互补的分析技术，如结合肽图谱或毛细管电泳与分离分子的质谱，为比较产品提供了有意义和敏感的方法。
广泛的分析表征可能会揭示参照产品和提出的生物仿制药之间的差异，特别是当使用能够辨别定性或定量属性变化的技术时。优先开发正交定量方法，以明确识别产品属性中的任何差异。然而，正交测试应该提供对质量属性的替代视角，或者在测试的有效性可能受到质疑的情况下。例如，使用紫外吸收和高效液相色谱（HPLC）来确定蛋白质含量可能被认为是正交的。然而，规格必须始终是明确的，在选择测试方法时不应有任何歧义。
3.15.批次的可追溯性
开发者必须确保包含和表征所有获得的参照产品批次。申请应涵盖所有评估的参照产品和提出的生物仿制药批次在不同研究中的数据和信息：物理化学、功能、动物和临床。应提供选择或排除分析研究中特定批次的理由。申请应包含分析测试和产品有效期的日期。通常，过期的参照产品批次不应包括在比较分析评估中，因为它们可能与未过期批次中的典型观察结果有偏差，导致过度估计的变异性。在某些储存条件下，如在-80°C下长期冷冻储存，可能可以接受测试过期批次。开发者应提交数据，确认储存条件不会影响产品质量。
对于参照产品批次收集的类似信息和数据，也应为提出的生物仿制药的每个生产的原料药和产品批次提供。
所有用于临床研究的参照和提出的生物仿制药批次（例如，药代动力学和药效学研究，如果适用，相似性和比较性临床研究）必须包括在比较分析评估中。
禁止在测试中结合两个参照产品的数据，因为这可能导致比仅依赖一个参照产品的数据更广泛的相似性接受标准，可能会扩大范围。
如果原料药从参照产品中提取用于分析研究，开发者应详细说明提取程序。他们必须证明该程序本身不会改变相关产品质量属性，包括杂质和产品相关物质。应有适当的控制措施，确保提取程序不会显著改变蛋白质的相关特性。
3.16.关键质量属性
在进行比较分析评估以建立生物相似性时，开发者应考虑所有影响提出的生物仿制药安全性和有效性的因素。与分析相似性相关的关键质量属性可分为固有属性和传统属性。固有属性包括制造过程中的可变属性，导致批次间变异性。这种分类涵盖了过程和产品相关因素，如细胞因子和抗体中的翻译后修饰。传统属性是固定特性，不受批次间变异性的影响，包括蛋白质的总质量（在某些细胞因子中但不在单克隆抗体中）、氨基酸序列以及其他报告的属性，如二硫键位置。这些特性记录在蛋白质数据库、专利、出版物和药典中。传统属性的另一类别包括非活性成分和产品特性（如pH和渗透压）的标签规格。
虽然传统属性规格在很大程度上表征了参照产品，但提出的生物仿制药仍需要与参照产品批次进行测试。这是因为参照产品没有义务遵守任何传统属性。此外，进行并行测试有助于减轻测试方法变异性在识别提出的生物仿制药与参照产品之间的临床意义差异方面的影响。然而，可以根据确保产品效力的既定原则独立建立各种质量属性的放行规格。例如，蛋白质含量（例如，±3%）、生物活性（例如，±15%）、翻译后修饰（例如，±10%）、亚可见颗粒（USP规格）、物理属性（例如，pH、渗透压、密度等，±10%）、聚集体（例如，参照产品多个批次平均值的±10%）、填充体积（USP规格）、杂质（例如，不超过3%，没有任何单一杂质超过1%，没有未识别的杂质）。开发者可以根据参照产品批次的多次分析提出其他限制。建立分析相似性和原料药和药品放行规格的核心原则是消除可能影响安全性，进而影响效力的不确定性。
关键质量属性是根据其对产品安全性和有效性的影响来识别的。表5.1提供了各种属性及其分类的非穷尽列表。测试方法的选择取决于属性的关键性。
3.17.参照标准
不允许使用提出的生物仿制药与公开可用的标准（如药典专论或参照标准）进行比较测试，以建立生物相似性。必须强调的是，任何来自第三方提供的药典专论或参照标准的规格都不适合建立生物相似性。
药典参照标准不适用于进行比较研究；它们的使用仅限于测试方法确认。合格的参照标准应由开发者基于其彻底表征的批次内部开发。
虽然将提出的生物仿制药与适合的、公开可用的、良好建立的蛋白质参照标准进行物理化学和功能比较可能提供有价值的见解，但仅使用这样的参照标准的研究不足以证明提出的生物仿制药与参照产品的生物相似性。例如，如果存在用于校准效力的国际标准，则需要将提出的生物仿制药的相对效力与该效力标准进行比较。根据ICH Q6B中概述的建议，内部参照标准必须始终经过确认并使用，以控制生产过程和产品。
通常，内部参照标准是从早期开发批次或用于临床研究的批次中开发的。在开发过程中和提交时，可能会有额外的参照标准被确认。理想情况下，开发者会建立并适当确认代表用于支持临床研究的提出的生物仿制药批次的主参照标准和工作参照标准。
在开发提出的生物仿制药时，参照产品批次通常作为初始参照标准进行确认。在生产了提出的生物仿制药的临床批次后，预计其中一个批次将被适当确认（包括与以前的参照标准衔接），用作发布、稳定性和比较分析测试的参照标准。理想情况下，一旦内部参照标准完全确认，就应该有足够的数量供整个提出的生物仿制药的开发使用。开发期间使用的所有参照标准批次都应适当确认。此外，参照标准的确认协议应包含所有相对于参照标准报告结果的分析方法。
对于所有相对于参照标准报告结果的方法，应将效力设定为100%，并包含一个狭窄的可接受效力范围，以确保对产品漂移的控制。例如，开发者应考虑使用预先确定的复制品均值的双侧置信区间（CI），其中均值相对效力和95% CI落在足够狭窄的范围内（例如，90%-110%）。应对多次参照标准确认进行评估，以解决确认历史中的潜在漂移。
开发者应避免使用校正因子来补偿参照标准之间的效力或生物活性差异。
使用提出的生物仿制药与公开可用的标准（如药典专论或参照标准）进行比较测试，以建立生物相似性，是不允许的。至关重要的是要强调，任何来自药典专论或第三方提供的参照标准的规格都不适合建立生物相似性。
4.制剂产品
提出的生物仿制药的产品表征研究应关注最适合分析程序的最下游中间体。所评估的属性应在随后的加工步骤中保持稳定。因此，表征研究通常在原料药上进行。然而，如果原料药经过重新配方并与制剂中的新材料接触，则必须考虑这些变化的影响。只要可行，如果制剂产品更适合特定分析，开发者应分析制剂产品。如果分析方法在原料药中更敏感地检测特定属性，但这些属性在制剂产品的制造过程中容易变化且至关重要，则可能需要对提取的蛋白质和制剂产品进行比较表征。
蛋白质对环境非常敏感。因此，辅料或主要包装的差异可能会影响产品的稳定性和临床性能。提出的生物仿制药与参照产品在配方和主要包装方面的差异可能会影响后续临床研究的选择性和针对性方法。建议参考2009年11月ICH行业指南Q8(R2)药物开发。开发者应清楚识别提出的生物仿制药中与参照产品不同的辅料。应评估并支持提出的生物仿制药与参照产品在辅料类型、性质和范围上的差异的可接受性，并提供适当的数据和理由。此外，提出的生物仿制药中包含不同的辅料应通过辅料的现有毒理学数据或专门为提出的生物仿制药制定的额外毒性研究来证实。
经过下游过程纯化后的原料药被视为化学实体而非生物实体。因此，它受到适用于任何其他化学药物填充和完成过程的所有cGMP要求的约束。然而，有一些特殊考虑，如蛋白质吸附到填充线上、填充过程中的聚集形成以及整个过程中浓度的变化。填充和完成设备的清洁验证带来了重大挑战。为了减轻化学实体可能污染蛋白质溶液（尽管浓度最小）的潜在污染风险，首选方法包括使用专用的填充头进行这些操作。通过使用一次性头部，进一步降低污染风险。
4.1.辅料
提出的生物仿制药可能含有与参照产品的处方信息中披露的不同的非活性成分。这种允许有助于开发者克服与配方相关的潜在专利保护，这些保护超出了生物实体的基因专利。然而，这种改变在证明非活性成分的选择不会引起毒性、药代动力学（包括吸收）或产品效力方面的不良反应方面引入了额外的挑战。尽管毒性事件很少见，但如由促红细胞生成素配方和给药变化引起的纯红细胞再生障碍（PRCA）[McKay, J, et al., Epoetin-associated pure red cell aplasia: past, present, and future considerations. Transfusion, 48(8), July 2008]方法突出了仔细考虑的重要性。早期的生物仿制药在对生物仿制药的理解还处于初期时面临这些挑战。今天，如果不进行全面调查以确定相关风险，就不会允许进行这样的改变。
建议开发者最初考虑参照产品的配方作为首选配方，依赖于参照产品的分析。他们应仅基于RP获得的概况建立任何非活性物质的放行限制。例如，在生物药物配方中常用的表面活性剂可能表现出30%-50%的浓度变化。表面活性剂的纯度至关重要，在某些情况下，建议在新容器中丢弃任何剩余的表面活性剂，以避免对产品的潜在安全风险。
作为次要选择，开发者可以考虑使用基于通常被认为是安全的用于注射产品的辅料的不同配方，避免使用不寻常的成分。
选择独特的非活性成分作为最终选择将需要更广泛的安全性研究，可能会留下关于配方的残留不确定性。通常，仅从分析评估中推断蛋白质的毒性并不可行。必须考虑辅料相互作用以及直接毒性。
4.2.稳定性
作为适当比较提出的生物仿制药与参照产品稳定性概况的一部分，进行加速和应力稳定性研究至关重要。还应采用强制降解研究以建立降解概况并实现直接稳定性比较。这些比较研究应包括多个应力条件（例如，高温、冻融循环、光照和搅拌），导致产品在定义的时间内逐渐降解。这些研究的结果可能会揭示需要进一步评估的产品差异，并有助于确定需要在制造和储存中增加控制的条件。请参考1996年7月ICH行业指南Q5C生物技术产品的质量：生物技术/生物产品的稳定性测试和2003年11月Q1A(R2)新药物质和产品的稳定性测试。提出的生物仿制药的足够实时、实时条件稳定性数据应验证提议的货架寿命。
监管机构期望对提出的生物仿制药进行并行定性和定量测试，以确定降解产物的类型和水平。然而，在获取生产日期与提出的生物仿制药相似的参照产品时存在挑战。此外，确定基于声明的货架寿命的理论降解率的可接受偏差仍然是一个关注点。
开发者必须提供至少三个批次的数据，可能包括置于稳定性测试下的开发批次。稳定性研究应该至少持续六个月，旨在获得具有高度统计显著性（r²）的降解线性回归系数。然后，这些降解率的斜率与理论速率进行比较。例如，如果一个产品的保质期为36个月，稳定性限制为不超过3%的降解，则可以计算回归线的理论斜率。提出的生物仿制药的降解率不应高于理论预测，即使参照产品显示出更高的速率，从而影响预计的到期日期。
开发者必须认识到，提出的生物仿制药的稳定性数据对于识别蛋白质结构中的差异以及其他导致降解的因素至关重要。强制降解研究具有特殊意义，因为它们突显了分子内部更细微结构的稳定性。
4.3.国际协调理事会
监管指南描述了化学、生产和控制（CMC）信息的考虑因素，以评估提出的生物仿制药与参照产品的相似性。所有产品申请必须包括一个完整的CMC部分，提供必要的信息（如表征、避免意外代理的安全性、过程控制和规格），以支持一致交付具有预期质量特征的产品。几个ICH指南（表5.2）与呈现本指南相关。然而，机构没有义务接受这些指南的建议。
4.4.测试方法示例
建议开发者基于产品的性质制定一个全面的测试协议。下面是一个建议的测试列表，用于TNF alpha阻断剂（表5.3）和肿瘤抗体（表5.4）的物理化学和生物学评估。ADCC：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；AlphaScreen®和AlphaLISA®（放大的发光邻近均相测定）是用于研究微孔板格式中的生物分子相互作用的基于珠子的测定技术；CD：圆二色谱；CDC：补体依赖性细胞毒性；CE-SDS：毛细管电泳-十二烷基硫酸钠；CEX-HPLC：阳离子交换-高效液相色谱；DSC：差示扫描量热法；FcRn：新生儿Fc受体；FRET：荧光共振能量转移；Gal：半乳糖化糖链；HDX-MS：氢-氘质谱；HILIC-UPLC：亲水性相互作用液相色谱-超效液相色谱；HMW：高分子量；icIEF：成像毛细管等电聚焦；ITF：内在荧光光谱；LC-ESIMS：液相色谱-电喷雾电离-质谱；LC/MS：液相色谱-质谱；LC-ESI-MS/MS：液相色谱-电喷雾串联质谱；PBMCs：外周血单核细胞；SEC：尺寸排除色谱；SEC-MALLS/RI：尺寸排除色谱-多角度激光光散射/折射指数；SPR：表面等离子共振；SV-AUC：沉降速度分析超速离心；UV：紫外；UV/VIS：紫外可见光。
4.5.风险评估
建议开发者创建一个风险评估工具，以评估和排名参照产品的质量属性及其对作用机制和产品功能的潜在影响。参照产品的某些质量评估（例如，从稳定性或强制降解研究确定的降解率）通常不应成为风险排名的一部分。然而，这些评估仍应在提出的生物仿制药和参照产品的比较分析评估中考虑。
开发风险评估工具时应考虑各种相关因素，包括：
对临床性能的潜在影响：建议开发者仔细考虑属性可能如何影响活性、药代动力学/药效学、安全性、效力和免疫原性。这种评估应从公开可获得的信息和开发者对参照产品的评估中得出。
某个质量属性周围的不确定性程度：当对属性变化与其临床影响之间的相关性了解有限时，由于相关不确定性，该属性应被评为更高风险。
高风险属性的分类：任何在性能类别（活性、药代动力学/药效学、安全性、效力和免疫原性）方面被认为高风险的属性都应相应分类。风险评估工具最好根据患者风险提供属性的优先级列表。属性的风险评分应与患者风险水平相对应。评分标准必须明确定义并合理化。每个属性的风险排名的理由应有文献和数据的相关引用支持。
4.6.统计学考虑
生物相似性评估主要依赖于统计学考虑。为了清晰起见，并说明监管机构如何解释数据，表5.5展示了与生物相似性测试相关的统计学概念。
4.7.定量和定性数据分析
彻底分析比较分析数据对于证明提出的生物仿制药与参照产品的相似性至关重要，同时考虑到临床非活性成分的微小差异。有多种方法可以分析分析数据的重要性。监管机构期望开发者全面了解统计技术，并为选择的统计建模提供理由。提出的生物仿制药与参照产品之间的任何临床反应差异都归因于关键质量属性（CQAs）的变异性。这一前提构成了识别CQAs的基础，考虑到生物制品中广泛的剂量-反应关系。因此，任何建模必须考虑这些可能性。
数据分析的一种可行方法是使用描述性质量范围来评估高风险和中等风险的定量质量属性。对于被评为较低风险的属性或那些无法定量测量的属性（例如，一级序列），可以使用原始数据和图形比较。
在比较分析评估中，质量范围（QR）方法的接受标准应从开发者对参照产品特定质量属性的分析中得出。QR应定义为样本均值（xˉ），其中s是基于参照产品批次的样本标准差。乘数（X）必须科学地合理化，并与监管机构讨论。根据我们目前的经验，由于需要大量的批次，不建议使用公差区间来建立相似性接受标准。开发者可以提出替代数据分析方法，包括等效性测试。
比较分析评估的主要目标是确认在提出的生物仿制药和参照产品中观察到的每个属性都具有相似的总体均值和标准差。当提出的生物仿制药批次值（例如，90%）的相当百分比落在该属性定义的QR内时，通常支持提出的生物仿制药与参照产品相似的结论。建议对高风险质量属性应用更窄的接受标准（例如，较低的X值）。
除了风险排名外，还应有其他考虑因素影响属性或测定的定量数据分析的选择。在确定适当的数据评估类型和结果分析时，需要考虑的其他因素包括：
属性的性质：被确定为高风险的属性应优先于由于不确定性而未知但潜在高风险的属性。 属性的分布：通常建议制造过程旨在密切匹配参照产品质量属性的分布中心。因此，假设具有相似的总体均值和标准差，QR是证明提出的生物仿制药与参照产品之间相似性的适当方法。对分布的任何关注可能需要更多信息或分析来支持QR方法或替代分析方法。例如，如果提出的生物仿制药中某个属性的分布与参照产品相比是偏斜的，根据属性的性质和在产品作用机制中的作用，可能会引起关注。在这种情况下，需要适当的科学理由来支持比较分析评估。当参照产品中的属性分布为非正态分布时，开发者应与监管机构协商以获得指导。 属性丰度：蛋白质产品内在的变异性意味着在高丰度（例如，百分比聚集或氧化）时存在高风险的属性，在低丰度发生时可能呈现显著降低或可忽略的风险。必须确认参照产品（由提出的生物仿制药确定，开发者对RP的分析）和提出的生物仿制药中属性的丰度。虽然限度测定并不总是需要QR评估，但定义和合理化选定的属性量的限制至关重要，考虑到其随时间的变化。 属性评估中的测定敏感性：尽管鼓励使用多种测定方法，但并非所有测定方法都需要相同的评估方法。用于检测产品差异的最敏感测定方法应进行QR评估，而其他评估相同属性的测定方法可以使用图形比较。必须为每个测定方法选择的评估方法提供理由。 属性/测定类型：某些属性或测定方法（例如，蛋白质序列、某些高阶结构评估测定方法或仅定性测定方法）可能不适合定量分析。比较分析评估计划应明确识别这些免于定量数据分析的测定方法，并说明排除的理由。 利用公开信息：公开信息可以影响比较分析评估中数据分析类型和接受标准的确定。开发者应寻求机构关于在评估中包含此类信息的指导。
定性分析建议：对于低风险属性，建议进行定性分析，并列数据显示（例如，光谱、热图、图形数据表示），这有助于视觉比较提出的生物仿制药和参照产品。这对于诸如核磁共振、质谱和生物活性等测定方法特别有用，这些方法仅用于分析评估，而不是产品发布验证。
4.7.1.风险排名
最终的比较分析评估计划必须包括属性的风险排名、每个属性/测定方法的数据分析类型和最终数据分析计划。它应指定预期可用于评估每个属性/测定方法的提出的生物仿制药和参照产品的批次，并提供为什么特定数量的批次足以评估的理由。比较分析评估计划应尽早与监管机构讨论，以就评估的属性/测定方法达成一致。在开始最终分析评估之前，通常在与他们的会议中，应将此最终计划提交给机构。开发者必须在开始测试之前最终确定并批准分析评估计划，其中包括接受和拒绝标准。
4.7.2.测定变异性
高测定变异性不应导致大的σR。在这种情况下，优化测定和增加复制品数量可以帮助降低变异性。此外，当等效性边际或质量范围过于宽泛时，可能有科学理由将它们缩小。在数据不遵循正态分布的情况下，发起人可以选择非参数公差区间，但这通常需要大样本量。
确定可接受的高变异性是具有挑战性的，但有几个指导原则可以帮助。首先，涉及评估仪器变异性——是否有更好的设备可用？其次，了解关键质量属性（CQA）变异性的限制至关重要。例如，许多药效动力学反应在生物测试系统中固有高变异性，类似于生物测定或结合测定（通常测试等效性范围）。例如，如果文献，特别是原始数据报告确认变异性为±30%，则可以考虑作为实现的限制。开发者可能会考虑使用超出药典或常规测试方法规定的测试，采用更高灵敏度和重复性测试。监管机构不会对使用的方法提出建议；它必须被证明是适当和合适的。之后，它可以用于发布目的的验证。样本的复制分析可以降低变异性；然而，机构通常不允许来自同一批次的多个样本。
4.8.功能评估
大多数生物制品以特定方式与身体相互作用，例如与受体、配体或底物结合。由此产生的效应通常可以在分子或细胞水平检测到。使用人类细胞或受体的体外测定通常用于评估与目标的结合以及随后的功能效应，有助于表征结构和功能。对于单克隆抗体（mAbs），除了与主要目标的互补决定区（CDR）结合外，Fc部分还包含不同受体的结合位点，可能触发各种效应功能，如补体激活、补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。评估这些与Fc相关的结合属性和效应功能也可以在体外进行。
4.9.正交研究
通常应提供许多比较体外研究的数据，其中一些可能已经来自与质量相关的测定，以评估提出的生物仿制药与参照产品之间在生物学活性方面可能存在的潜在差异。
这些研究应包括相关测定：
• 与参考产品在药效学效应和药代动力学中涉及的已知目标（例如，受体、抗原、酶）的结合。
• 与参考产品药效学效应相关的细胞的信号传导、功能活性或活性。
• 这些研究需要进行比较，而不仅仅是专注于评估反应本身。
为确保清晰的结果，应使用适合其目的的适当方法。这些测试方法不需要验证。
它们应足够敏感、特异，并具有足够的区分能力，以证明观察到的质量属性差异在临床上无关紧要。比较提出的生物仿制药和参照产品在药效学目标上的浓度-活性/结合关系至关重要，特别是在潜在差异最敏感检测到的浓度范围内。
4.9.1.测试批次
使用足够数量的参照和提出的生物仿制药批次进行测试至关重要，代表临床使用意图的材料。测试的批次数量应考虑测定和批次间变异性。应该足以得出关于提出的生物仿制药和参照产品之间变异性和相似性的有意义的结论。虽然通常建议使用6-10个批次以获得适当的测试能力，但提供非定量数据的测定可以在更少的批次上进行。然而，使用较少的批次会增加批次失败的风险。
这些测定应共同覆盖与参考产品和产品类别相关的整个药理学和毒理学范围。在许多情况下，体外测定可以比动物研究更有效地检测提出的生物仿制药和参照产品之间的差异。因此，这些测定对于提出的生物仿制药的非临床比较评估至关重要。
功能测定在表征蛋白质产品、补充物理化学分析和量化蛋白质的功能方面发挥着至关重要的作用。
如果参照产品表现出多种功能活性，开发者必须进行一套适当的测定，以评估与该产品相关的一系列相关活性。
例如，具有多种功能域的蛋白质表现出酶活性和受体介导的活性，如果与产品性能相关，则应评估这两种活性。对于可以通过不同参数（例如，酶动力学或与凝血因子的相互作用）测量功能活性的产品，比较不同产品之间每个参数的表征是至关重要的。
开发者应认识到某些类型的功能性测定可能存在的潜在局限性，例如高变异性，这可能会阻碍检测到提议的生物仿制药与参考产品之间的显著差异。由于高变异性测定可能无法有意义地确定生物相似性，建议开发者创建变异性较小且对产品功能活性变化敏感的测定方法。此外，体外生物活性测定可能无法完全预测蛋白质的临床活性。这些测定通常不会预测产品的生物利用度（药代动力学和生物分布），这可能会影响药效学和临床性能。糖型分布或其他翻译后修饰的差异可能会显著改变生物利用度。因此，在评估支持生物相似性的数据质量时，应考虑这些局限性，可能需要额外的信息来解决不确定性。最后，功能性测定对于在非临床和临床研究中检测中和抗体至关重要。
当蛋白质产品活性涉及结合时，分析测试应根据其特定的结合特性对提议的生物仿制药进行表征。例如，如果与受体的结合是蛋白质功能固有的，则必须测量这一特性，并在比较研究中使用。
表面等离子共振、微量热测量或经典的Scatchard分析等几种方法可以提供结合动力学和热力学的见解。这些信息可以与提议的生物仿制药的高阶结构的功能活性和表征相关联。
5.体内评估
众所周知，生物技术衍生的蛋白质可能会产生体内效应，这些效应无法仅通过体外研究完全理解。因此，可能需要非临床体内评估来提供补充信息，这取决于与物种或设计相关的适当体内模型的可用性。
5.1.确定体内研究的需要
在评估非临床体内研究的需要时，应考虑多种因素，包括但不限于：
• 识别参考产品中未识别的潜在相关质量属性（例如，新的翻译后修饰结构）。
• 认识到提议的生物仿制药与参考产品之间质量属性的潜在重大定量差异。
• 配方中显著差异，例如使用生物技术衍生蛋白质不常见的辅料。
• 虽然上述因素可能不会固有地要求体内测试，但全面考虑这些问题对于衡量关注程度和确定体内研究的必要性至关重要。
• 如果提议的生物仿制药，在对其理化和生物学特性进行比较分析并满足非临床体外研究后，确保了人体测试的安全性，那么体内动物研究可能被认为是不必要的。
• 在影响药代动力学（PK）和生物分布的产品固有因素（如广泛的糖基化）无法在质量和体外水平上充分表征的情况下，体内研究可能是不可或缺的。在这种情况下，开发者应仔细权衡在动物中进行这些研究的必要性或作为临床测试的一部分，例如涉及健康志愿者。
• 当需要额外的体内信息时，应考虑相关动物物种或其他相关模型（例如，转基因动物，移植模型）的可用性。
• 如果没有可访问的相关体内动物模型，开发者可以选择进行人体研究，遵循旨在减少潜在风险的原则。
5.2.体内动物研究
省略了动物毒理学研究，但这并不完全消除了动物测试的潜在需要，尽管这种情况很少见。这是因为动物可能缺乏引发治疗蛋白质药理反应所需的受体，这对于确定毒理学和临床反应至关重要。尽管如此，一些机构，如印度的机构，仍然坚持要求进行动物毒理学研究。例如，在印度，给予人类剂量的4到5倍的过量剂量以建立安全性，这构成了完全浪费的练习。
如果需要进行体内评估，研究的重点（药代动力学、药效学和安全性）取决于对额外信息的需求。动物研究应精心设计，以获得最大信息量。3R原则（替代、改进、减少）应整合到任何体内研究的设计中。根据使用的终点，研究结束时可能不需要牺牲动物。研究持续时间（包括观察期）的理由应基于参考产品的药代动力学行为及其临床应用。
在可行且合理的情况下，应对提议的生物仿制药与参考产品的药代动力学和药效学进行定量比较，包括类似于预期人体暴露的剂量-浓度-反应评估。
关于安全性研究，无论选择哪种物种，都建议采取灵活的方法。通常，不鼓励在非人类灵长类动物中进行标准重复剂量毒性研究。如果适当合理，可以考虑改进的重复剂量毒性研究设计（例如，仅使用提议的生物仿制药和参考产品的一个剂量水平、一个性别，不恢复动物）或在生命过程中评估安全参数（例如，临床体征、体重、生命功能）。
对于评估单剂量的研究，通常选择给药范围内的最高剂量，需要基于参考产品的预期毒性进行理由。
不建议在不相关的物种中进行毒性研究（即，仅用于评估与杂质相关的非特异性毒性）。由于提议的生物仿制药和参考产品制造商之间的生产过程可能存在差异，可能会有与过程相关的杂质（例如，宿主细胞蛋白）的质量差异。应努力最小化这些杂质，这是降低相关风险的最有效策略。
产品相关变体（例如，糖基化模式、电荷变体）的定性或定量差异可能会影响生物技术衍生蛋白质的生物功能，并应使用适当的体外测定进行评估。这些差异和杂质可能会影响免疫原性和超敏反应风险。承认通过动物研究预测这些效应的困难，建议在临床研究中进一步评估。
虽然动物中的免疫原性评估通常不预测人体免疫原性，但可能需要解释体内动物研究。因此，应收集和储存血液样本，以便在需要时对药代动力学/毒代动力学数据进行潜在的未来评估。
局部耐受性研究通常没有必要。然而，如果引入了新的辅料，而没有在预期的临床给药途径中的经验，评估局部耐受性可能变得必要。如果进行了其他体内研究，评估局部耐受性可能会被整合到研究设计中，而不是进行单独的局部耐受性研究。
动物研究的结果可以用来加强提议的生物仿制药的安全性评估。这些研究也有助于证明提议的生物仿制药与参考产品之间的生物相似性。
如果提议的生物仿制药在结构和功能数据上有局限性，或者对其质量有担忧，一般毒性研究无法充分解决这些担忧。
5.3.动物药代动力学和药效学测量
在特定情况下，如果可用，使用药代动力学和药效学测量比较提议的生物仿制药和参考产品的单剂量动物研究，可以为支持生物相似性的证据做出贡献。评估动物中的药代动力学和药效学的主要目标是识别提议的生物仿制药和参考产品之间的结构差异。然而，动物药代动力学和药效学评估不能取代人类药代动力学和药效学研究的需要。在大多数情况下，可以在少数灵长类动物物种中进行PK/PD研究。主要目标不是建立统计等效性，而是展示测试动物之间的整体相似性。
5.4.动物免疫原性测试
通常，动物免疫原性评估不会预测人体对蛋白质产品的潜在免疫反应。然而，一些监管机构允许在动物中进行免疫原性测试作为生物相似性的额外支持，尽管一些机构声称动物免疫原性评估可能会揭示其他分析方法未检测到的提议的生物仿制药和参考产品之间的潜在结构或功能差异。这类研究的例子有限：
• 在一般毒性学研究1中，使用ECL桥接免疫原性测定法在食蟹猴血清中检测到抗Etanercept抗体。每周两次皮下给药1或15 mg/kg。
• 与参考产品相比，促红细胞生成素在大鼠中表现出更高的药物抗体（ADA）发生率。这种情况可能是由于给药途径（皮下给药比静脉给药更具免疫原性）和参考产品中存在人血清白蛋白（HAS）。
• 在大鼠中测试了Filgrastim可能相关的免疫原性。研究涉及Sprague Dawley大鼠：每组10只大鼠/性别/组+5只大鼠/性别/组作为提议的生物仿制药或RP的对照组和高剂量组；TK对照组：每组6只大鼠/性别；TK 12只大鼠/性别/组，剂量在0、20和500 µg/kg，每天皮下给药29天。
• 在Tg197转基因小鼠关节炎模型中评估了Infliximab的疗效、药代动力学和免疫原性。使用了十个治疗组，4/性别/组用于疗效研究+3只雄性/组用于TK，剂量为1、3或10 mg/kg的提议的生物仿制药和RP，每周两次通过腹腔注射给药七周，从3周龄开始。此外，还增加了一个每性别两只动物的补充对照组，在3周龄时被处死以开始治疗。
