1.引言
治疗性蛋白的免疫原性与超敏反应相关。第1型超敏反应涉及产生IgE亚型的抗药物抗体（ADA）。然而，IgE ADA和高滴度IgG ADA的产生可能对包括输液反应和/或过敏性休克在内的重大不良反应有贡献，尽管这些类型的不良反应并不常见。IgE ADA复合物可以与嗜碱细胞和肥大细胞上的Fcε受体结合并交叉连接它们，导致IgE介导的过敏性休克。此外，IgG ADA可以与治疗性蛋白复合，IgG ADA免疫复合物可以交叉连接中性粒细胞上的Fcγ受体，从而释放类似组胺的血小板活化因子。此外，未能从血液中清除的大型治疗性蛋白-ADA复合物在组织如肾脏、滑膜和脉络丛中沉淀，导致组织损伤和器官衰竭。当ADA与内源性蛋白同源物发生交叉反应时，会发生最严重的不良事件。例如，多年给患者使用重组促红细胞生成素（EPO）后意外地发展为纯红细胞再生障碍（PRCA），这一特征被归因于ADA的发展，而没有发展出任何先前的重大免疫原性问题。ADA导致EPO的配方和给药途径的修改。诺华公司开发的通用EPO的临床试验显示了PRCA的发生；在这种情况下，PRCA的发生被归因于药物产品中大量存在的钨微粒引起的产品聚集。ADA与内源性蛋白发生交叉反应的其他临床情况包括人类生长激素配方中存在的聚集物引起的中和ADA，以及重组治疗产品如因子VII中残留宿主细胞蛋白（HCP）引起的ADA。鉴于这些严重结果是由交叉反应性ADA引起的，已经开发了广泛的体外方法来测量ADA的存在。此外，目前也有用于识别单克隆抗体和HCP免疫反应驱动因素的方法。考虑到这些历史结果，监管机构建议生物治疗药物开发商使用结构化方法来测量免疫原性风险。例如，欧洲药品管理局（EMA）已经发布了关于生物技术衍生治疗蛋白免疫原性评估的指南，其中将影响治疗蛋白免疫原性的因素分类为有益的患者、疾病或产品相关类别。除了EMA指南外，美国食品药品监督管理局（FDA）最近对新药产品和现有产品的通用版本的指南也建议了免疫原性风险评估方法，例如，2014年FDA指南—治疗蛋白产品的免疫原性评估指南。这些指南强调了T细胞表位对免疫原性的贡献，并提到了调节性T细胞的免疫调节作用。此外，“关键质量属性”记录在FDA赞助的质量设计倡议中，侧重于制造“工艺开发”，指的是可能使治疗性蛋白具有免疫原性的因子。最近发布的合成肽药物指南继续遵循监管指南趋势，坚持T细胞反应的重要性。值得注意的是，FDA不将小于40个氨基酸的肽视为蛋白质，但免疫原性测试仍然是这些肽的考虑因素，类似于蛋白质的免疫原性测试。FDA建议免疫原性评估应进一步扩展到合成相关的杂质，并建议肽药物开发商确定与活性药物成分共纯化的杂质中T细胞表位的存在。对于基于肽或蛋白质的药物，主要氨基酸序列本身可能是免疫原潜力的强决定因素。除了主要氨基酸序列之外，机构指南指出可能使特定个体倾向于免疫反应的患者和疾病相关类别。一些例子包括免疫缺陷和伴随的免疫抑制治疗，如甲氨蝶呤，可能会降低免疫原性和自身免疫性，而自身免疫可能会增加由于ADA的风险。相比之下，产品相关因素，即最终药物产品本身固有的有助于免疫原性的因素，可能包括糖基化概况的修改，生物物理和生化属性，肽制造杂质和/或降解产物，或在配方准备期间引入的因素。显然，监管指南和更新的临床前免疫原性风险评估方法正在趋于共识，为这篇综述提供了动力。
2.专注于T细胞依赖性免疫原性评估和缓解
虽然免疫原性测试涉及ADA检测，但根本原因是T细胞依赖（Td）免疫反应，无论是由于聚集物、HCP、杂质、由于目标参与导致的免疫调节，还是药物序列本身。因此，Td免疫原性风险评估侧重于可能来自产品序列（蛋白质或肽）的已知肽段，称为T细胞表位。某些药物衍生的肽/表位可能与人类白细胞抗原（HLA）/主要组织相容性复合体（MHC）II类分子结合，然后肽-MHC在抗原呈递细胞（APC）表面呈递给T细胞。更具体地说，从药物物质处理和衍生的T细胞表位（T辅助细胞表位）对ADA的发展至关重要。T辅助细胞表位由HLA II类分子的一个子集（主要是HLA DR，还有DP或DQ）呈递给CD4+ T细胞，然后释放出B细胞成熟和增加ADA结合亲和力成熟所需的必需细胞因子。这些相互作用发生在淋巴器官的生发中心，树突状细胞和B细胞向T滤泡辅助细胞和T滤泡调节细胞呈递T细胞表位，调节体液免疫反应的成熟。正如识别T辅助表位对免疫原性风险评估至关重要一样，通过去免疫化去除T细胞表位是Td免疫原性风险缓解的关键。去免疫化过程现在完全集成到专注于缓解Td免疫原性风险的临床前计划中。降低免疫原性（调节性T细胞表位）的T细胞表位对于引发含有“人类”成分的蛋白药物的免疫反应同样重要，如人类来源的单克隆抗体、酶替代疗法和其他人类来源的生物治疗药物。循环调节性T细胞（Tregs），也称为自然Tregs（nTregs），有助于调节人类免疫反应，已知是表位特异性的。在IgG中发现调节性T细胞表位（Tregitopes）可以改善单克隆抗体的风险评估。
2.1.定义：生物治疗药物的T细胞依赖性免疫反应
生物治疗药物的免疫反应可以分为两大类。在第一类生物治疗药物中，对“外来”蛋白（对患者来说是外来因子）的免疫反应是典型的，类似于对病原体、疫苗或同种型抗原的反应。血液因子如凝血因子VIII就属于这一类，因为它们在完全没有或部分缺乏内源性对应物的个体中发展。对于像庞贝病的酸性α-葡萄糖苷酶这样的替代酶也是如此。在第二类生物治疗药物中，对自体蛋白（“自身”蛋白）的免疫原性表明B细胞和/或T细胞耐受性的破坏，类似于某些自身免疫疾病中对自体蛋白的反应。自身耐受性由循环调节性T细胞主动调节。这些T细胞对自身蛋白（如免疫球蛋白）中的表位序列做出反应（在HLA结合特征方面可能与非自身蛋白相同），但它们对激活其T细胞受体（TCR）的反应不同。例如，Franco和Sette在川崎病免疫球蛋白治疗患者中发现了分泌IL-10以响应IgG中HLA DR限制性T细胞表位的调节性T细胞。在英夫利昔单抗治疗患者中也记录了对源自英夫利昔单抗的特定T细胞表位的IL-10反应（可能是由于Treg激活）。鉴于许多自身蛋白如单克隆抗体含有调节性T细胞表位，破坏免疫耐受的机制尚不明确，类似于对外来蛋白的免疫反应机制，但可能包括表位模仿、T细胞交叉反应、存在微量先天免疫激活剂如Toll样受体激动剂的存在，和/或聚集蛋白。Toll样受体的遗传变异、共刺激分子的多态性以及细胞因子受体的修饰等可能涉及耐受性的破坏。患有自身免疫疾病的患者可能有这些遗传异常之一，并且可能被认为有更高的发展ADA的风险。
2.2.T细胞独立与T细胞依赖反应
除了T细胞反应的调节外，像ADA产生这样的体液免疫反应可能是胸腺独立（T细胞独立[Ti]）而不是Td起源的。例如，当结构模式如聚合物重复或碳水化合物分子通过B细胞受体（BCR）直接激活B细胞时，B细胞可能以Ti方式激活。Ti激活的B细胞可以从Td激活中区分出来。Ti激活产生的抗体在同型和亲和力方面都是有限的，如果产生了记忆B细胞，那么抗体反应就不是长期的。相比之下，Td激活的B细胞以类别转换（IgM到IgG）为特征，如果产生了记忆B细胞，那么抗体反应具有更高的亲和力，更强大，更持久。生物治疗药物给药后IgG抗体的发展通常表明治疗药物正在推动Td免疫反应。根据定义，Td反应取决于T细胞通过抗原处理和呈现蛋白来识别治疗蛋白衍生的表位。由于人类群体表达不同类型的HLA II类等位基因，抗原表位与HLA之间的相互作用可能在人类群体表达的HLA等位基因谱中表现出不同的结合稳定性。这种HLA遗传多态性及其对特定肽结合（HLA限制）的影响是患者遗传学（HLA单倍型）成为对特定蛋白治疗药物免疫反应的主要决定因素的主要机制。
2.3.先天免疫反应
先天免疫系统控制Td免疫的启动。当被称为APC的先天免疫细胞在外围被激活时，它们会迁移到局部淋巴结，在那里它们可以在适当的共刺激信号存在下将药物衍生的肽抗原呈递给抗原特异性T辅助细胞。与TCR和BCR的特异性不同，先天免疫系统的细胞表达胚系编码的不变受体，称为模式识别受体（PRR），它们识别常见的微生物模式（病原体相关分子模式）。PRR包括几个家族的受体，如Toll样受体、RIG-1螺旋酶和C型凝集素受体。PRR不仅识别微生物模式，还识别一类称为警报素或与危险相关的分子模式（DAMPs）的警报信号，这些信号由受压和死亡的细胞大量释放，以促进局部炎症反应。DAMPs有助于对抗病原体、组织损伤和DAMP介导的炎症期间的压力，这发生在治疗蛋白给药期间，并促进适应性免疫反应。此外，宿主细胞和过程衍生的杂质，称为先天免疫反应修饰杂质（IIRMIs），可以通过与PRR相互作用促进适应性免疫，刺激先天免疫系统。体外和体内研究表明，即使在微量水平，IIRMIs也可以破坏对治疗蛋白的耐受性，并促进不需要的免疫反应。对Td免疫原性的新理解包括疾病状态，例如，针对心血管疾病患者的治疗通常不太可能与增加ADA的产生相关，而自身免疫疾病患者可能表现出一系列可以导致对治疗反应增加倾向的免疫功能障碍。或者，一些患者群体可能有不寻常的HLA分布，这些分布与更大程度地呈现来自药物序列的T效应表位有关，导致更高或更低水平的免疫原性。最后，药物本身的作用机制可能会干扰或促进免疫系统的激活，导致免疫原性风险更高或更低。在100人中看到一两个人（每100人）具有比其他人更高的基线免疫反应并不少见；这些高风险个体也可能对传递载体有夸张的免疫反应。受试者的基线免疫状态（包括B细胞和T细胞库以及HLA单倍型）可以影响他们对生物制剂产生免疫反应的能力。此外，如上所述，生物治疗药物在自身免疫疾病患者中可能更具免疫原性，因为受体患者的免疫系统存在潜在的炎症状态。在过去的几年里，针对自身免疫疾病患者的特定药物包括抗TNF药物，在选定的患者群体中具有显著不同的免疫概况。自身免疫疾病患者中ADA滴度增加的解释各不相同；然而，这些患者可能有缺陷的调节性T细胞或缺乏功能性调节性T细胞细胞因子受体（白细胞介素[IL]-2和IL-10）。调节性T细胞或调节性细胞因子的功能受到干扰，这些细胞因子对Treg功能至关重要，可能会显著降低Treg对含有Tregitopes的药物的反应，包括许多用于治疗自身免疫疾病的单克隆抗体。像甲氨蝶呤和TNF抑制剂这样的药物可以恢复Treg功能，当药物达到治疗水平时，可能会降低ADA滴度。这是RA活跃、加重的患者ADA滴度高的一个潜在解释，这也可能会解释为什么在有效抗炎药物治疗后ADA可能会消失。
2.4.药物功能作为免疫原性的决定因素
针对免疫系统的生物治疗药物的出现已经明确表明，药物本身的作用也可以促进或调节免疫原性，并在抗TNF药物的活性中发挥重要作用，因为TNF对调节性T细胞的作用，如上所述。抗TNF治疗后Treg功能的改善可能会导致在临床过程中对抗TNF药物的ADA滴度降低。同样，IL-2，一种调节性T细胞所需的细胞因子，不仅可以诱导亲调节环境，还可以降低药物产生ADA的可能性。这种机制可能有助于低剂量IL-2治疗在自身免疫疾病中的有效性。相反，IL-2也可以增强效应T细胞反应的功能，并已在治疗病毒和肿瘤疾病中以高剂量使用。
2.5.药物靶标和免疫原性：检查点抑制剂
一些药物如检查点抑制剂（CPIs）增强免疫反应；因此，CPIs在治疗侵袭性癌症方面已证明成功。然而，一些CPIs比预期更具免疫原性，可能导致随着继续治疗而失去疗效。一个假设是，它们的作用降低了可能存在于CPIs序列中的自然Tregitopes的耐受作用和/或增强了效应T细胞对药物序列中外来表位的反应。
2.6.药物靶标和免疫原性：抑制抗炎细胞因子
与CPIs相反，某些抗细胞因子药物比预期的免疫原性要小得多。其中一种药物是托珠单抗，一种抗IL-6生物制剂，目前广泛用于治疗RA和其他自身免疫疾病。值得注意的是，由于IL-6是T细胞激活所必需的，干扰IL-6可能会减少T细胞参与，从而降低ADA滴度。利妥昔单抗是另一种可能直接干扰免疫原性的药物；这种药物靶向发育中的B细胞上的CD20，并减少抗体分泌浆细胞的形成，这可能解释了为什么在利妥昔单抗治疗期间通常检测不到ADA。
2.7.肽类药物
在过去几十年中，肽合成的重要进展促成了治疗性肽药物制造的重大转变，并扩大了进入临床管线的新型肽的数量。对于单克隆抗体、血液因子和重组酶，肽药物中存在的HLA结合序列可能会激活调节性或效应T细胞，因此，这些肽在临床使用中可能表现出免疫原性。从完全重组到合成肽药物的转变引起了监管机构对合成相关杂质可能诱导不需要的免疫反应（包括产生ADA）的担忧。监管机构对选定的通用肽的经验导致了FDA仿制药办公室最近引入的通用肽产品指南草案。肽类药物的免疫原性主要与肽合成方法有关，因为可能会引入可能难以从最终药物制剂中去除的肽杂质。这些杂质可能含有可能有助于T细胞激活（随后，ADA）的新T细胞表位。在某些情况下，杂质的存在与过敏性休克有关。在肽合成过程的每一步可能会无意中产生几类肽杂质，如氨基酸插入和删除、非对映异构氨基酸的合并以及氨基酸R基团的氧化。杂质也可能在储存过程中产生。相对于Td免疫原性，当无意的氨基酸序列修改导致含有新HLA结合配体或改变现有表位的TCR面向轮廓的杂质时，可能会引入新的T细胞表位。
2.8.计算机辅助筛选
当前的免疫原性筛选实践通常从计算机辅助筛选评估开始，然后根据需要进行HLA结合测定、T细胞测定和MHC相关肽组学（MAPPs）。一些团队从MAPPs开始，不使用计算机辅助工具；然而，MAPPs消耗资源且成本高昂。对可用计算机辅助工具的更多经验和熟悉可能会促进这些工具作为未来免疫原性评估的第一步的更大适应。本节简要介绍用于计算机辅助筛选的工具，并强调这些工具的改进。
2.9.T细胞表位预测
ADA介导的反应是由于适应性免疫反应，由T细胞对HLA结合在APC表面展示的线性肽表位的反应支持。对于通过常规途径（外源性的，即静脉内、皮下和局部）输送的生物治疗药物，通过II类途径向CD4+辅助T细胞的呈递最为相关；然而，如上所述，涉及CD8+ T细胞反应的生物治疗药物由病毒载体和细胞治疗输送是一个日益关注的问题。幸运的是，现在可以高度自信地预测T细胞表位。T细胞表位序列的核心残基（由九个氨基酸组成）定义了与HLA DR、DP和DQ等位基因的口袋的结合亲和力和稳定性。在几个公共和学术平台上，有多种方法可以评估完整蛋白的免疫原潜力，有时这些方法与基于假设结合亲和力和T细胞前体频率的数学模型或与MAPPs确定的肽组搭配。用于表位扫描的公共网站可能会出现和消失，并且可能会修改，通常不通知，这导致随时间变化的免疫原性解释的变化。出于这个原因，许多中到大型制药公司导入在线算法并在其防火墙内运行它们，以减少知识产权披露的风险。其他公司或机构使用像安全访问的商业级ISPRI工具包这样的基于网络的工具，或将免疫原性解释外包给商业研究组织。一些工具，如商业ISPRI平台，使用独特的算法和代码来识别单克隆抗体序列中的Treg表位，并对表位内容相对于随机预期进行统计评估，并针对自身性（即耐受潜力）进行调整。使用标准化的“免疫原性量表”，可以直接将新的生物药物产品与其他已知的非免疫原性和免疫原性产品进行排名。该工具包不仅具有寻找“类人”（见下一节）的表位的新算法，因此不太可能参与激活的T细胞，而且还具有直接进行计算机辅助分析的去免疫化和耐受化方法。
2.10.筛选自身性（耐受潜力）
T细胞不仅识别肽序列，还识别与HLA分子裂隙中结合的肽复合物。在任何HLA配体中，某些氨基酸与HLA分子本身接触，而其他氨基酸对TCR可接近。如果来自特定表位的TCR面向残基在来自人类蛋白质组的多个HLA结合序列中保守，则该表位可能会激活特定于这些人类蛋白的T细胞。这可能导致由自然Tregs产生的调节性反应，或者由于T细胞在胸腺选择期间的无力或删除而导致的有限或无反应。对于许多HLA等位基因，HLA结合裂隙中的锚定肽位置是已知的，其他残基与TCR相互作用。可以采用诸如JanusMatrix之类的算法，将来自候选治疗药物的预测表位与人类蛋白质组进行筛选，以区分更类似于自身、因此可能被耐受的肽与那些人类交叉保护有限、因此更可能被人类免疫系统识别为“外来”的肽。治疗衍生的“外来”表位很可能是针对治疗性T细胞反应的目标。
2.11.筛选相关肽库
如果确定了T细胞表位，那么也可以确定表位是否已经在体外或体内进行了测试。免疫表位数据库（www.iedb.org），是美国国家过敏和传染病研究所的一个合同项目，现已整理了20,860篇期刊文章和直接提交的内容，编目了近622,105个肽表位。通过将新序列与此数据库筛选，研究人员可以确定开发产品中的表位是否已报告为MHC配体，以及是否已知T细胞反应的表型，这允许将已知序列与具有更大免疫风险的未知序列进行分类。此外，当识别到风险信号时，包含来自APCs的序列的蛋白质组学数据库可以揭示组织和疾病状态之间的重要关系，以通知临床研究期间的仔细监测。7.2.12 按免疫原潜力对生物制剂候选物进行排名 在所有其他因素都相等的情况下，给定蛋白质中包含的T细胞表位的负担越大，该蛋白质诱导免疫反应的可能性就越大。可以通过在ISPRI工具包上执行的操作来实现一种生物制剂与另一种生物制剂的比较，通过对HLA等位基因的表位含量得分进行标准化并根据序列长度进行调整。区域表位密度也可以驱动免疫反应。
3.评估免疫原性风险的体外方法
广泛的验证体外测定可能成本过高；因此，在当前的临床实践中，正在执行使用先进的计算机辅助工具进行的分析。计算机辅助分析后，可以进行HLA结合和T细胞测定，或外包给商业研究组织。这些测定可以应用于（i）药物开发的非常早期阶段，以设计预测免疫原性低的新治疗药物，（ii）在后期阶段，对在人体首次研究中表现出高免疫原性的临床资产进行去免疫化，或者（iii）在项目终止后回顾性地进行，以解释观察到的高临床免疫原性背后的机制和风险因素。显然，对于新的（以及旧的生物药物的通用版本）生物药物要成功，如果在开发阶段的临床前进行免疫原性风险评估，则最具成本效益。
3.1.人类白细胞抗原结合测定
产生T细胞反应的第一步是APC将肽抗原呈递在HLA II类/MHC II类分子上供T细胞识别。一旦通过计算机辅助分析鉴定出潜在表位，可以通过HLA结合测定来首先验证预测，按照Steere等人描述的方法进行，以评估肽与一个或多个HLA超型等位基因结合的能力。超型等位基因指的是共享表位结合基序的HLA-DR等位基因家族。利用这些超型家族，可以在覆盖全球超过95%的人口的同时，对相对较少的等位基因进行结合测定。产生有意义的结合测定数据的一个关键因素是设计要测试的肽序列和测试肽的来源。II类肽的核心结合区域包含九个氨基酸，位于HLA分子的肽结合槽中。这种相互作用由核心结合区域两侧的邻近残基稳定，并延伸到结合槽外面。在设计结合测定的肽时，重要的是要正确地将结合基序置于HLA结合测定中，并具有最佳肽设计。简而言之，感兴趣的肽与特定等位基因的标记追踪肽和可溶性HLA超型单体一起孵育至平衡。第二天，停止结合反应，将混合物转移到预先用pan抗HLA-DR抗体包被的测定板中，并孵育过夜。在此孵育后，进行显色，肽结合通过时间分辨荧光光谱间接测量。使用固定浓度的标记追踪肽和一系列浓度的测试肽，可以生成一个多点剂量范围曲线，从而计算出IC50值，该值不仅提供肽与HLA结合能力的信息（是/否），还提供肽对给定HLA-DR超型的相对亲和力。IC50值可以用来根据它们对给定HLA等位基因的亲和力将肽分类，如高、中等、低和非结合。随着新技术的出现和可访问性，研究结合反应的动力学将提供更多细节。肽纯度也会影响结合测定的结果。某些制造商的肽纯度可能低至60%，这是由于制造过程和原料的纯度。肽内的杂质可能导致假阳性结果，因此导致错误的结论。结合测定的肽应具有最低85%的纯度，并应作为净肽订购。错误的结果也可以归因于错误的合成。例如，非结合肽可能是在同一台机器上合成的，该机器用于早期合成HLA结合肽。这种污染可能会破坏药物开发计划；参考中提供了一个示例。
3.2.外周血单个核细胞测定
从全血中分离的外周血单个核细胞（PBMC）是用于体外细胞基础测定的免疫原性预测中最广泛使用的效应细胞来源。实验中使用的PBMC可以来自健康志愿者或受影响患者的样本中新鲜分离，或从未冷冻保存的库中解冻，可能覆盖适当的疾病相关或常见且有充分文献记录的HLA等位基因的代表性。由于高通量和易于执行，使用全血PBMC或CD8+ T细胞耗尽的PBMC的PBMC测定仍然是最常用的体外细胞基础测定，用于测量免疫原性潜力。
3.3.树突状细胞-T细胞测定
体外单核细胞衍生的树突状细胞（moDCs）和自体CD4+ T细胞的共培养越来越多地用于评估药物候选物和产品关键质量属性（CQAs）的免疫原性潜力。DC-T细胞或DC-PBMC方法将系统简化为细胞介导免疫的基本组成部分：CD4+ T细胞与APCs在相关细胞比例下相互作用，这提高了灵敏度，因为实验系统中潜在反应细胞的总数远大于整个PBMC方法。然而，这种方法耗时且需要分离和分化单核细胞为DCs，然后进行抗原装载/脉冲步骤，这可能依赖于试剂、操作员和材料。单核细胞可以从PBMCs开始，通过塑料粘附或使用磁珠分离方法进行分离。然后使用细胞因子或其他因素进行moDCs的分化和成熟，同时添加所需的生物治疗药物、肽片段或聚集体。成熟的、脉冲化的moDCs通常与自体纯化的CD4+ T细胞共培养，以允许抗原呈递和T细胞激活，这取决于免疫原性潜力。反应的测量方法与PBMC测定相同，如上所述。moDC-T细胞系统的高级变体是模块化免疫体外构建（MIMIC R）模型，它能够可靠地产生针对生物制剂如蛋白质、肽、单克隆抗体和包括核酸在内的新型方式的抗原特异性先天和适应性免疫反应，也已用于这些目的。
3.4.流式细胞术分析T细胞表型
流式细胞术已成为免疫原性测试的宝贵工具，允许对免疫反应进行单细胞水平的特征描述。随着使用更多激光和滤光片组合的更复杂仪器以及染色和检测方法的进步，可以从患者的血液样本中获得大量信息。T细胞表位具有免疫原性或耐受性的能力。虽然在细胞培养中测量Tregs的扩增可能具有挑战性，但可以通过在存在免疫原性肽的情况下与效应T细胞共培养来确认Treg表位的存在。在这个旁观者测定中，激活的Tregs抑制抗原特异性T效应细胞对免疫原性肽的反应。标准旁观者测定利用对抗原的免疫记忆，如破伤风毒素，大多数细胞群体通过疫苗接种或自然暴露已经接触过。PBMCs在存在灭活的破伤风类毒素和Tregitope的不同浓度下培养10天。细胞经过染色分析，然后通过流式细胞术计数（Teff细胞定义为CD3+CD4+CD25+FoxP3low，Treg细胞定义为CD3+CD4+CD127lowCD25+FoxP3hi）。然后可以通过CFSE稀释测量细胞增殖。在存在Tregitope和破伤风类毒素的情况下，与单独存在破伤风类毒素相比，T效应细胞的增殖减少。
3.5.主要组织相容性复合体相关肽组学测定
在1990年代初，首先描述了一种称为MAPPs的额外方法。这种测定在识别APCs表面呈递的相关HLA上的处理肽方面证明是有价值的。此外，这种方法提供了健康受试者和疾病患者的抗原处理变异性的详细信息，并且与HLA相关的肽的测序可以确认/验证使用算法识别的序列。液相色谱-质谱灵敏度和蛋白质组学分析的最新进展使得HLA结合映射测定可以在临床前用于映射生物治疗药物中存在的潜在抗原序列。并非所有潜在的HLA结合肽都被APCs处理和呈递，因为HLA结合的部分展开和天冬氨酰蛋白酶修剪的结合。此外，HLA DM和HLA DO的编辑功能进一步提高了要呈递的肽的选择性。在这些测定中，APCs在体外产生并与感兴趣的治疗蛋白孵育24小时，之后它们经历细胞因子/有丝分裂原诱导的成熟步骤以上调HLA表达。细胞溶解后，HLA受体-肽复合物进行免疫沉淀，其中复合物被分离，然后进行酸洗脱步骤，肽从HLA复合物中解离，然后通过液相色谱-质谱测定肽序列。使用蛋白质组学蛋白质数据库算法可以进行内源性肽的减法和肽到治疗的映射。这些测定可能会识别出可以针对去免疫蛋白工程的抗原肽。此外，来自疾病患者的全血分析可以提供呈递改变以及对重组替代治疗的耐受性方面的见解。算法、先天和适应阶段输出以及MAPPs，所有这些都在案例研究中使用，已应用于抗IL-21受体ATR-107。对一级序列的计算机辅助分析预测了重链互补决定区（CDR）2中的两个重叠的CD4+ T细胞表位，以及轻链CDR2中的一个单独表位。MAPPs确认了LC CDR2中的表位作为DCs呈递的主要肽。ATR-107诱导DC激活，这可以通过细胞表面激活标记的上调表达、细胞因子产生增加以及在共培养条件下自体CD4 T细胞的特定增殖来证明。使用MAPPs验证计算机辅助预测结果可以为开发商提供保证。然而，MAPPs测定中肽的洗脱并不确认肽是否推动Td免疫反应。T细胞反应可能因响应序列的T细胞表型而异。当MAPPs在没有额外工具探索响应洗脱肽的T细胞表型的情况下使用时，可能会过高预测免疫原性。个体表位驱动免疫原性的重要性在Cassotta等人最近的一项演示中得到了加强，他们对针对α4整合素的人源化抗体纳他珠单抗的免疫原性进行了MAPPs分析。利用计算机辅助和体外细胞测定的组合，如与患者外周血液中分离的B细胞进行的MAPPs测定，作者确定两名接受纳他珠单抗治疗的多发性硬化症患者发展出中和ADA，对位于轻链V区的CD4+ T细胞表位有T细胞反应。
4.通过去免疫化和耐受化减轻免疫原性
4.1.去免疫化
减轻免疫原性的理想起点是通过工程设计分子，使其在患者中引发不需要的免疫反应的风险较低。这可以通过结合去免疫化和耐受化过程来实现。在单克隆抗体的情况下，去免疫化过程包括两种非互斥方法：超人类化，即将小鼠CDRs移植到人类来源的抗体框架中，以及移除T细胞表位序列，这些序列是使用表位预测对数和体外确认测定的组合来识别的。将小鼠CDRs移植到人类V区域通常会导致亲和力下降或丧失，这可以通过在人类框架中对药物-靶标相互作用至关重要的位置引入小鼠氨基酸（所谓的“回变”）来恢复。这些回变可能会引入额外的T细胞表位；因此，需要应用迭代和及时的去免疫化策略，以在分子序列被优化以实现预期的预测效果时，耗尽去除表位的可能性。在这种情况下，增强的二元替代技术可能是一个有效的组合方法，但需要进一步探索。
4.2.耐受化
与去除有害的CD4+ T细胞表位互补的是引入T调节序列，这个过程被称为耐受化。耐受化在替代疗法中特别有趣，在替代疗法中去除T细胞表位可能会影响药物功能，或者在基因疗法中用来平衡由衣壳抗原决定基引起的细胞毒性反应的激活。事实上，预防性给药腺相关病毒AAV衍生的衣壳蛋白融合到Treg表位可以减少病毒衣壳特异性CD8+ T细胞反应，并伴随着Treg细胞计数的同时增加。迄今为止，预期减少去免疫化和/或耐受化分子的免疫原性的证明依赖于体外和体外测定或临床前模型。高度免疫原性的单克隆抗体的去免疫化形式尚未在临床环境中完全适用，因为生物治疗药物开发商专注于开发具有更长专利寿命和更大操作自由度的新型、免疫原性较低的分子。
4.3.治疗诱导的耐受性
减轻ADA发展风险的努力通常集中在降低治疗蛋白的内在免疫原性上，对于患有血友病A和B的患者，他们对重组凝血因子产生抑制分子，已经建立了免疫耐受诱导协议。针对基于单克隆抗体的药物的ADA反应也可能导致反应丧失和药物更换，即使是完全人源化的分子也是如此。在这种情况下，已经构想并审查了各种诱导对生物治疗药物免疫耐受的方法。对其他救命治疗蛋白的ADA反应，如酶替代疗法，已经损害了治疗效果，有时甚至导致死亡。对于基因疗法，对转基因和病毒载体的ADA发展仍然是成功治疗的主要障碍：对病毒衣壳有预先存在的中和抗体反应的患者没有资格接受治疗，发展出治疗诱导的体液免疫的患者将没有资格重新剂量。“去免疫化”指的是去除推动T辅助介导的免疫反应的T辅助表位可能会减少T辅助免疫反应，而“免疫工程”或“耐受化”指的是通过保留或引入Treg表位（Tregitopes）到蛋白质序列中来识别和增强Treg反应。这种计算机辅助方法使得引入调节性T细胞表位以减少免疫原性的潜力成为可能。或者，可以使用现有的药物制定与免疫耐受诱导相关的方案，这些药物针对与ADA发展相关的免疫瀑布的主要参与者，通过抑制有害的效应T细胞反应或激活耐受途径。前者可以通过干预与T细胞和B细胞激活相关的机制或通过使用免疫抑制剂如环磷酰胺或甲氨蝶呤、抗CD3或抗CD20抗体、蛋白酶体抑制剂或多种耗尽剂的组合来实现。已经应用了几种这样的方法，包括同时使用甲氨蝶呤来减少T细胞介导的免疫原性。在庞贝病和对FVIII疗法抑制剂的耐受性诱导中，目前使用的方案涉及多种药物的组合，如利妥昔单抗（消除抗体分泌B细胞）和静脉注射免疫球蛋白（结合并去除抗体或诱导耐受性）。庞贝病的方案中加入了甲氨蝶呤，这种修改后的方案已经成功地在患有高风险庞贝病的婴儿中建立了对阿糖苷酶α的耐受性。其他正在考虑的方法包括同时给予纳米粒子形式的雷帕霉素方案或与Tregitopes共同给予。在体外条件下，注入扩增的Tregs和Bregs并表达抗原特异性受体可以控制血友病A临床前模型中抑制物的发展。大多数免疫耐受诱导方法仍处于开发初期，这些干预措施的长期效果仍然未知。然而，已经达到临床环境的耐受性方案的价值是激励继续评估免疫耐受诱导作为减轻生物治疗药物不需要的免疫原性的手段。
4.4.抗药物抗体测定标准化
由于缺乏ADA测定的标准化和协调，跨临床研究比较治疗蛋白的免疫原性一直具有挑战性。对于给定的治疗蛋白，关键测定参数（如灵敏度和药物耐受性）的变异性可能导致各个实验室对临床发病率的不同估计。在这种情况下，由Innovative Medicines Initiative（IMI）资助的ABIRISK财团（针对生物制药免疫：预测和分析临床相关性以最小化风险）产生了单克隆抗体，用作ADA测定中的标准。这些通用标准可用于基准测定灵敏度和药物耐受性，常规监测测定性能，并验证生物仿制药ADA测定中的抗原性等效性。此外，基于这些标准的免疫原性评估可以帮助临床医生了解如果观察到效果丧失的剂量策略。针对利妥昔单抗、纳他珠单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗或干扰素β的各种同型和亲和力的单克隆中和抗体是从用相应的治疗蛋白免疫的患者中分离的B细胞产生的，如前述方法所述。生产规模扩大和进一步的表征分析使用ABIRISK验证ADA测定正在进行中。最终，所有抗体将在国家生物标准和控制研究所公开提供。
5.新方式和免疫原性风险评估
如在“新方式”部分所讨论的，新的治疗方式，如细胞和基因疗法，在临床环境中已显示出免疫原性。这些方式可以刺激免疫反应的机制是复杂的，因为高水平的工程、细胞内表达、引入工程基因产品和复杂的输送系统。主要为蛋白质治疗药物开发的修改免疫原性风险评估工具和测定可用于最小化这些新型治疗的免疫原性风险。
5.1.特定细胞系/可溶性T细胞受体
依赖于APCs展示处理肽段在HLA类I/II背景下与T细胞库相互作用的新体外测定方法，被证明对于进一步定义抗原特异性和免疫反应传播非常有用。此外，使用表达类I和类II HLA的工程B细胞系有助于高通量预测细胞内处理和呈现潜在抗原表位。例如，在竞争性方法中，使用可溶性TCRs识别HLA参考肽复合物，用于检测单等位基因APC系呈现潜在免疫原性表位（默克，未发表数据）。
5.2.建模
如上所述，可以在开发的早期阶段部署各种计算机辅助和体外工具，以指导蛋白质工程和设计预测免疫原性低的药物候选物。然而，这些工具可以用来评估与产品相关的风险，特别是基于序列的风险，但它们可能不会揭示与免疫原性相关的因素，如患者和治疗相关因素。免疫原性的总体风险依赖于不同风险因素的加权和整合，其中一些是经验性的或理论性的。免疫原性定量系统药理学（QSP）模拟器可以帮助简化和统一这种整合。它们结合生物治疗药物、生理学基础的药代动力学（PK）和免疫反应的机制模型，以模拟大规模临床试验并预测免疫原性的发生率。可以模拟关键变量如HLA基因型、联合疗法、剂量方案和给药途径对ADA发生率的影响，以及ADA对药物PK的影响。QSP模拟器仍在开发中，它们需要更多的经验输入数据和完善与免疫系统相关的参数，如抗体发展的动力学。验证后，QSP模拟器可以促进个性化管理和减轻免疫原性。
5.3.免疫原性重点组织
由于在准确进行免疫原性风险评估以及测量和确定ADA的临床相关性方面存在挑战，制药公司、生物技术研究所和合同研究组织联合起来，通过解决现有差距在该领域取得进展。创建了科学非营利协会，如欧洲免疫原性平台（www.e-i-p.eu/）。该平台旨在促进免疫原性专家之间的交流，鼓励和领导与监管机构的互动，以及与更广泛的科学界分享知识和免疫原性领域的最新进展，并提供关于免疫原性的实践和监管方面的培训课程。
ABIRISK财团是另一种协作方法，旨在促进免疫原性科学的进步。临床和基础研究学术中心与工业伙伴合作进行了为期6年的研究项目，并解决了与不需要的免疫原性相关的一些主要问题和实际障碍，如现有预测工具的价值、ADA测定、协调和标准化、检测到的ADA的临床相关性、患者风险因素的识别和预测标记。
这种广泛的跨实验室合作在欧洲、美国和以色列产生了一个衍生倡议。BIOPIA（https://ki.se/en/cns/biopia）是一个非营利性努力，由欧洲实验室组成，这些实验室在生物制药PK和许多疾病的免疫原性方面拥有专业知识，这一倡议旨在提高对免疫原性的意识，并倡导整合药物水平和ADA测试以改善患者管理。该网站提供有关ADA和药物水平测试的信息，主要是帮助临床医生实施免疫原性和药物水平的常规临床测试。在美国，也在进行类似的努力，作为AAPS（美国制药科学家协会）的治疗蛋白免疫原性社区的一部分。免疫原性风险评估和缓解工作组进行了一项调查，以表征性能和协调风险评估方法，包括通过成员调查的算法和体外测定。未来的重点是适应当前工具并开发创新测定，以回答有关新方式和下一代疗法的问题。
5.4.监管机构对免疫原性的看法
最近的FDA指南提出了一种基于风险的方法来评估治疗蛋白诱导的免疫反应及其对安全性和效力的影响。还建议在生物仿制药开发早期制定基于风险的策略，最好在人源化之后，并与其他开发能力努力并行。早期评估将使由于结构和序列而产生的负债有更强大的理解。通过药物开发的不同阶段持续评估风险，可以指导临床应用的生物分析策略，这在以下部分描述。风险评估包括由于与蛋白质表达和纯化以及配方/辅料诱导的聚集或降解相关的工艺变化而引起的翻译后修饰的风险。
5.5.将风险评估整合到临床前管线中
简而言之，免疫原性风险评估应考虑潜在的治疗益处，并将其与考虑患者人群类型和适应症以及治疗靶标的以往经验的免疫原性潜在影响进行权衡。
对生物制剂候选物的早期评估允许基于识别风险的最低概率进行排名。还有去免疫化/序列优化的空间，其中去除几个氨基酸以去除表位或插入调节性序列以驱动抑制性T细胞反应。此外，基于风险的策略应包括由于与蛋白质表达和纯化相关的工艺变化引起的翻译后修饰的负债，以及由于配方/辅料引起的聚集或降解。
在开发基于风险的策略期间，还应考虑治疗蛋白的早期药理学知识，包括靶标参与和随后激活免疫途径。临床前毒理学研究为生物仿制药的安全性提供了见解。
可以在不同阶段用于候选物选择以最小化免疫原性风险的工具和测定。例如，在计算机辅助筛选中，可以使用基于计算机的算法评估不仅氨基酸序列对潜在HLA类I和II结合和可能发生化学修饰的残基，还可以评估聚集体的蛋白质结构。可以进行体外测定以评估生物治疗药物在不同供体组中激活T细胞的潜力。这些测定可以与整个蛋白质一起进行，以可能包括靶标参与，或者与重叠肽一起进行，以排除靶标参与。MAPPs和HLA结合测定旨在识别分子内的抗原。当在药物开发过程中出现特定问题时，可以使用包含免疫系统额外部分的体外和体内模型。评估非序列生物物理参数影响的先天免疫系统激活测定可以用来优化工艺开发和配方或工艺变化。临床免疫原性数据和患者特征是验证、评估和改进与靶标和非靶标负债相关的临床工具和测定关联问题的有效性的关键组成部分，特别是当临床前和临床靶标具有同源性时。如果有先前的临床经验，基于风险的策略也可以成为优势，例如，已经处于商业阶段的类似靶标的蛋白质的临床经验。此外，如果对一种疾病适应症的治疗蛋白有足够的临床经验，那么与安全性和效力相关的研究结果也可以总结为正在为新IND开发的新药（IND）的应用。
6.五年展望
由于免疫原性风险评估方法的进步，以及针对产品（主要序列和配方）的去风险工作，以及对可能导致ADA发展的患者因素的理解的提高，大多数生物治疗药物开发商正在将评估整合到药代动力学/药效学（PK/PD）、安全性和临床效力结果中，以更好地了解新产品或生物仿制药的风险。在药物开发过程中（设计新序列、选择领先化合物、去风险识别的负债或比较生物仿制药优先级），应持续考虑使用新兴技术（新的计算机辅助、体外和体内测定）。这些方法还提供了风险估计，包括对临床免疫原性的个体风险（HLA类型）的先验知识。目前不推荐在动物模型中进行体内研究以进行免疫原性测试，因为动物模型中的HLA与人类HLA之间的差异。相反，体外测定更适用于评估细胞介导的免疫反应的风险。在从一种模型物种过渡到另一种模型物种或人类时，可以预期MHC相关免疫反应的变化。在小鼠、非人灵长类和其他模型物种中与MHC结合的T细胞表位通常与与人类MHC结合的表位不同。大多数生物制剂的临床前研究通过在体外条件下测试免疫原性来规避这一问题，其中选择人类PBMC样本以广泛覆盖人类MHC。
在未来5年内，预计大部分风险评估将首先在计算机辅助下进行，然后再转移到（有限的）体外和体内模型。这是因为大多数进行全面临床前开发的制药公司实际上为单一目标生成了数千个潜在候选物。计算机辅助分析是免疫原性的一个很好的初步方法，它允许在需要的地方使用体外方法详细检查某些分子特征。随着更多结果可供公众审查，计算工具的准确性将提高。机器对机器界面，使得可以集成和高通量筛选同一目标的多个候选物，将同时改善临床开发候选物的临床前选择。药物开发商应该熟悉可用的工具，因为预计要筛选的候选物化合物数量将使其无法在没有自动化的计算机辅助分析流程的情况下进行管理。未来，计算机辅助分析（和体外验证）的范围也可能包括HLA类I免疫原性评估和体外测定。这是由于引入了新的治疗方式和病毒载体，它们与MHC类I途径相互作用。
免疫原性风险评估领域已经成熟，并将在新的治疗方式进入临床环境时继续发展。
免疫原性或不良免疫反应被定义为治疗性生物制剂产生针对自身和相关蛋白的免疫反应的倾向，或诱导免疫学相关的非临床效应或不良临床事件。在治疗性生物制剂开发过程中有两种类型的免疫原性：
• 期望的免疫原性通常与疫苗接种有关。注射抗原（疫苗）刺激针对病原体（病毒、细菌、癌细胞等）的免疫反应，目的是保护宿主。
• 不期望的治疗性生物制剂的免疫反应也可能中和它们的生物活性并诱导不良事件，不仅通过抑制治疗性生物制剂的效力，还通过与内源性蛋白对应物发生交叉反应，导致其生理功能丧失（例如，中和抗体对治疗性EPO导致PRCA，通过中和内源性蛋白）。这种免疫原性概述是治疗性生物制剂发现和开发中后者的不良免疫反应。
抗原处理由专业的APCs如DCs、巨噬细胞和B细胞执行。这个过程包括两个步骤：首先，抗原捕获，其中抗原被送至细胞抗原处理机制；其次，抗原处理和呈递，其中与MHC分子结合的抗原肽被产生以呈递给适应性免疫细胞。细胞外抗原通过吞噬作用、巨噬细胞吞噬作用和受体介导的内吞作用被APCs捕获。在内质网或溶酶体的酸性环境中，抗原被降解成许多含有T细胞表位的免疫原性肽。摄取抗原后，MHC类II分子首先在内质网中合成，然后通过高尔基体运输，与抗原肽结合形成肽-MHC II复合物，然后这些复合物被呈递到APCs表面。TCRs可以识别肽-MHC-II复合物以激活T细胞以启动免疫反应。抗原呈递的质量取决于肽-MHC复合物的亲和力，肽-MHC复合物稳定性与免疫反应之间存在直接关系。APCs与CD4+ T细胞的结合能力通过DC-T细胞测定来确定。
治疗性生物制剂的免疫反应可以显著影响治疗性生物制剂的效力和患者安全性。第一代治疗性单克隆抗体是小鼠来源的，基于这些抗体的药物在患者中引起高度不良的免疫反应，因为抗体；这些免疫原性反应在人源化单克隆抗体中大部分被抑制，但仍有一定的关注。
不良免疫反应导致ADA的产生，导致许多临床相关效应（表7.1），导致过敏性休克、细胞因子释放综合征和交叉反应中和内源性蛋白，这些蛋白介导关键功能。当ADA的存在得到确认后，除了滴度和分析抗体的中和能力外，进一步的特征化可能是有用的，例如，急性超敏反应的免疫球蛋白类别。也可以对临床重要的ADA进行进一步分型，或确定ADA的“阈值”水平，超过这个水平对药物效力和安全性有显著影响。
从根本上说，鉴于目前许多治疗性生物制剂正在开发中，关于免疫原性的最重要因素是它是PK的协变量；当针对治疗性生物制剂发生免疫原性时，它会增加药物从体内的清除并减少对治疗性药物的暴露。患者相关和产品相关因素可能会影响治疗性生物制剂的免疫原性。这些因素是免疫原性风险评估（表7.2）的关键元素，并需要在免疫原性测试协议中考虑。
7.免疫原性调查
应在目标人群中调查免疫原性，因为动物测试和体外模型并不总能预测人类的免疫反应。在生产变更后证明产品可比性以及在产品获批后生产过程变更的情况下，免疫原性发挥着重要作用。然而，该协议不适用于开发过程中对拟议的生物仿制药产品进行测试。即使是微小的差异也可能影响生物活性、效力或安全性，包括拟议生物仿制药的免疫原性。
评估治疗性生物制剂中的物理化学或配方属性，如杂质、异质性、聚集体形成、氧化和脱酰胺作用，可以指导免疫原性的预测和开发免疫原性较低的治疗剂。此外，预测治疗性生物制剂中潜在的免疫原性表位是提高药物安全性和效力的重要且有效的策略。在治疗性生物制剂开发过程中，有多种临床前免疫原性评估策略可用，如表7.3所示。
7.1.测定
生物仿制药开发商应在临床免疫原性评估中评估以下与抗体相关的参数：
滴度、特异性、相关亚型分布、药物开发的时间进程、持续性、消失、对PK的影响以及与临床后遗症的关联。
产品活性中和：对所有相关功能（例如，摄取和催化活性、酶替代治疗的中和）的中和能力。
开发商应在启动任何临床免疫原性评估之前与监管机构协商测定的充分性。
开发商应开发能够灵敏检测免疫反应的测定方法，即使在循环药物产品（拟议的生物仿制药产品和参考产品）中也是如此。应尽可能使用相同的测定方法和相同的患者血清来评估拟议的生物仿制药产品和参考产品。建议在生物仿制药开发的早期阶段开发和验证免疫原性测定，并应对拟议的生物仿制药产品和参考产品进行验证。
建议采用多层次测试方法，包括开发和验证筛选测定、确认测定、滴定测定和中和测定。筛选测定，也称为结合抗体测定，用于检测与治疗蛋白产品结合的抗体。确认测定建立ADA对治疗蛋白的特异性。滴定测定描述ADA反应的强度。中和测定评估ADA的中和活性。在测定中设定适当的截止点对于最小化假阴性结果的风险至关重要。
应同时开发独立ADA结合测定，包括拟议的生物仿制药产品或参考产品作为捕获配体。每个测定都应经过验证，并已证明能够在药物存在的情况下灵敏检测ADA。应使用两种测定方法测试两种治疗组的样本，以证明ADA对拟议的生物仿制药产品和参考产品的交叉反应性。偏离这种方法应有科学依据。
7.2.灵敏度
建议筛选和确认IgG和IgM ADA测定至少达到100 ng/mL的灵敏度，根据生物仿制药的风险和先前知识，灵敏度限制超过100 ng/mL可能是可接受的。
7.3.特异性
测定特异性的缺乏可能导致假阳性结果；在证明单克隆抗体、Fc融合蛋白和Ig融合蛋白的抗体反应特异性方面存在挑战，并就如何管理这些挑战提供指导。
7.4.选择性
测定结果可能会受到基质或船上治疗蛋白产品的干扰。未能建立测定选择性可能导致非特异性信号，掩盖阳性结果。
7.5.精确度
结果应在测定运行内部和之间可重复；测定精确度对于ADA评估至关重要，因为测定变异性是确定截止点和确保弱阳性样本被检测为阳性的基础。
7.6.可重复性
如果多个实验室在研究中运行一个测定，开发商应建立数据可比性，包括测定灵敏度、药物耐受性和测定精确度。
7.7.稳健性和样本稳定性
生物测定的复杂性使它们容易受到测定条件变化的影响。因此，评估和优化参数（如细胞通道数、孵育时间和培养基成分）至关重要。此外，需要制定短长期稳定性管理计划，以保持抗体反应性。
7.8.格式
开发商应考虑每种类型的测定格式的优缺点，包括通量、灵敏度、选择性、动态范围、检测各种Ig亚型的能力、检测快速解离抗体的能力以及试剂的可用性。应考虑洗涤次数和强度，这可能会影响测定灵敏度和表位暴露。
7.9.试剂
如果阳性对照抗体、阴性对照和系统适用性对照是专门为测定生成的，那么开发商应确保关键试剂的一致性测定性能。
7.10.报告结果
应评估测定方法的适当性，最常见的是定性测定。表7.4展示了常见的筛选测定，表7.5展示了抗体测试的测定方法。
7.11.生命周期管理
在没有观察到临床后遗症的情况下，拟议的生物仿制药产品和参考产品之间的免疫反应差异可能会引起关注。这样的测定可能需要进一步评估（例如，延长随访评估期）。随访评估的持续时间应基于以下因素决定：(1)免疫反应生成的时间进程（如中和抗体、细胞介导的免疫反应的发展）和预期的临床后遗症（由参考产品的经验提供信息），(2)免疫反应消失的时间进程和治疗停止后预期的临床后遗症，以及(3)产品的管理时间。例如，对于长期给药的剂，建议随访期为1年，除非可以根据支持生物相似性的证据总体科学地证明更短的持续期。
然后开发商应获得生命周期管理报告，随着产品经历各个阶段，报告应包括以下部分：
免疫原性风险评估：该评估应针对治疗蛋白，并包括产品质量和主观因素的信息。
分层生物分析策略和测定验证摘要：开发商应总结每个临床开发阶段的评估策略。
临床研究设计和详细的免疫原性采样计划：开发商应包括所有进行评估的临床研究的采样计划。
临床免疫原性数据分析：开发商应包括所有具有免疫原性组成部分的临床研究的免疫原性分析摘要。
结论、风险评估和缓解策略：开发商应讨论免疫原性如何影响患者群体的蛋白质产品的安全性和效力，包括产品如何在上市后阶段进行监测。
7.12.免疫原性测试方法
在没有质量水平相关性以及对临床效力（效力降低或丧失）和安全性没有负面影响的情况下，免疫原性的微小差异可能是可以接受的。评估观察到的免疫原性差异的临床影响可能具有挑战性，因为样本量和随访时间有限。如果观察到的差异的临床影响不确定，例如，由于潜在严重不良反应的罕见性或免疫反应的缓慢发展，则可能需要通过上市后监测或特定风险管理策略更新风险管理计划。
免疫原性研究旨在检测和表征对产品的免疫反应，并调查ADA与PK和PD以及效力和安全性的相关性。因此，应将免疫原性评估包括在关键临床研究的计划中，包括同步采样ADA和相关生物标记物（如果有的话），评估生物仿制药的效力和安全性。
7.12.1.人群
选择适合比较免疫原性的人群很重要。在选择适当人群时，应考虑免疫能力、免疫抑制治疗的先前或同时使用以及参考产品免疫原性的历史数据等因素。由于免疫原性测试通常是作为关键的比较安全性和效力研究的一部分进行的，因此在设计程序的临床部分以证明生物相似性时，必须考虑上述因素。
如果需要，应根据观察到的差异、给药途径、剂量-反应曲线、治疗窗口和潜在的临床影响来证明免疫原性研究的类型。效力、安全性和免疫原性测试的目标人群需要对免疫原性及其后果敏感，并代表产品指示的人群。在高风险情况下，应在批准后的基础上分析样本。
在几种情况下，如果药物治疗（先前或同时）可以抑制免疫反应，则健康人群将是首选；一个很好的例子是，优先在健康人群中评估非格司亭产品。
7.12.2.并行评估
比较免疫原性研究旨在排除拟议的生物仿制药产品和参考产品之间在免疫原性方面的临床意义差异。能够影响生物仿制药安全性和效力的抗体存在是非常令人关注的；例如，通过改变PK、诱发过敏性休克或中和产品及其内源性蛋白对应物，可以克服这个问题。对于每个治疗组，比较研究应描述ADA反应的发生率和强度、ADA发展的进程、ADA持续性以及ADA对生物仿制药安全性、效力和PK的影响。
在拟议的生物仿制药产品开发过程中需要进行并行比较免疫原性研究。如果初始的物理化学和体外测试表明差异，则更有可能检测到免疫原性差异，特别是在分子已知具有高度免疫原性的情况下。
免疫原性测试应与PK、安全性和效力测试相结合。在确认性结合测定中测试阳性的结合ADA患者样本也应测试其中和药物的能力，除非有不这样做的强有力的理由。选择适当的中和抗体测试格式至关重要，应考虑药物的作用机制。根据作用机制，竞争性配体结合测定或基于细胞的测定可能是适当的。
7.12.3.终点
选择与治疗蛋白产品免疫反应相关的临床免疫原性终点或PD措施（例如，抗体形成和细胞因子水平）时，应考虑参考产品报告的免疫原性问题。开发商应预先定义临床免疫反应标准（例如，显着临床事件的定义，如过敏性休克），在可能的情况下使用既定标准，并在研究开始前就这些标准与监管机构达成一致。
7.12.4.采样计划
采样频率以及分析的时机和程度将取决于特定药物的风险评估。采样计划应设计得能够区分暂时阳性的患者和已发展为持续抗体反应的患者。治疗后的采样期应足够长，以便对治疗蛋白触发的免疫反应的持续性得出结论，并发现被治疗蛋白本身抑制的免疫反应。治疗后样本收集的时机由蛋白质的半衰期和ADA测定的药物耐受性决定。在治疗的早期阶段需要更频繁的采样，此时患者通常处于ADA发展的最高风险。长期免疫原性的跟踪采用较少频率的采样，可以提供有关免疫原性的发生率和后果的额外信息。在持续长期治疗的情况下，通常应在授权前期间提供1年治疗的免疫原性数据，但如有适当的科学理由，可以进行较短的跟踪。
应系统地按计划对患者进行免疫原性测试，包括重复采样、症状驱动的方式，并在怀疑发生不希望的免疫反应时收集额外的样本。几种与产品相关的因素将影响对治疗蛋白的免疫反应的发展。因此，检测免疫反应的采样计划应适应并分别适用于每个产品，考虑其PK（例如，消除半衰期）和ADA测定的药物耐受性。始终应收集基线样本。
开发商在描述ADA反应的动力学和潜在免疫介导的不良效应时应使用普遍接受的术语，考虑可比产品的经验以及相关的监管和科学出版物。在治疗期间，应在给药前收集样本，因为样本中活性物质的残留水平可能干扰测定。
如果产品可以通过不同途径给药，则开发商应在上市许可申请中证明其对每种给药途径的免疫原性评估方法的合理性。
7.12.5.依赖于药代动力学
ADA可以影响PK，特别是消除阶段。非中和性“结合”抗体有时可能会调节而不是仅仅减少产品的效力，例如，通过延长半衰期。PK的变化可能是抗体形成的早期迹象。因此，鼓励开发商在所有重复剂量研究中同时进行PK和免疫原性采样。
7.13.安全性和效力关系
应根据免疫原性风险评估考虑间歇治疗相关的免疫原性，例如，来自其他类似产品的经验，潜在免疫原性的风险，增强效应，以及接触生物仿制药后抗体的持续性或出现。
ADA的存在可能或可能没有临床后果。因此，临床开发应基于潜在风险的分析以及检测和减轻这些风险的可能性。免疫介导的不良效应分析计划应基于风险分析，包括产品（类别）的先前经验，蛋白质中可能的免疫原性结构和患者群体类型。预先存在的ADA患者可能表现出不同的效力和安全性概况，应在可行时作为亚组进行分析。分析计划应定义与急性或延迟超敏性、自身免疫和效力丧失相关的症候群。潜在的免疫不良效应应在风险管理计划中得到解决。
7.13.1.免疫原性测试的管理
尽管开发商努力选择免疫原性潜力低的化合物，但对治疗蛋白的有害免疫反应并不总是可以避免的。在这种情况下，开发商应尽可能探索减少临床开发中观察到的免疫原性不良影响的可能性。在某些情况下，免疫抑制或抗炎共用药可能显著预防或减少不良免疫效应。在某些情况下，如凝血因子所观察到的，可能可以通过耐受化方案重新建立免疫耐受，例如，通过给予较大剂量的治疗蛋白。临床研究应记录这样的治疗方案。
7.14.示例研究
附录3提供了一些从EMA和FDA获得生物仿制药批准的研究协议的详细信息。
7.14.1.英夫利昔单抗
虽然主要效力分析表明，在第30周时，拟议的生物仿制药（Flixabi）和参考产品的等效ACR20反应率相同，但在个别测定时间点，拟议的生物仿制药队列中通过高灵敏度测定测量的ADA率大约高出5%-12%（在试验的任何时间点，拟议的生物仿制药队列中近50%的患者ADA阳性）。然而，由于主要终点在预定的可比性范围内，因此未观察到对任何分析的效力参数有任何有意义的影响。
7.14.2.依那西普
虽然产品（Benepali）通过了所有生物相似性测试，但在第24周观察到整体ADA形成有显著差异。ADA差异的临床效应似乎可以忽略不计，并且在治疗8周后差异大部分消失。PK研究通常比临床试验更敏感，能够检测潜在的产品相关差异，这可能解释了为何类似的效力发现不能推翻PK的差异。这可能被视为过于严格。然而，效力试验的结果不仅取决于药物暴露，还取决于生物物质在体内的有效药理作用。因此，这两种类型的研究目标是不同的。
