研究简介
基质刚度在细胞重编程中起到了双相调节作用，特别是对成纤维细胞到神经元(iN)的转换效率。研究结果表明，中等刚度的基质(20 kPa)能够显著提高重编程效率，而更硬(40 kPa，玻璃)或更软(1 kPa)的基质则效果较差。这一发现与之前的研究不同，之前的研究通常假设基质刚度对细胞功能的调节是单调的，即只是比较硬和软两种条件。本研究通过使用可调刚度的水凝胶系统，揭示了基质刚度对表观遗传状态和细胞重编程的非单调性调节机制。
研究中，通过ATAC测序分析显示，在中等刚度水平下，神经基因的染色质可及性呈现相同的趋势。同时，研究观察到在20 kPa基质上，核内组蛋白乙酰化和组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性达到峰值，抑制HAT活性则消除了基质刚度效应。G-肌动蛋白和cofilin作为共转运蛋白，将HAT转运到细胞核，随着基质刚度的降低而增加；然而，在软基质上，importin-9的减少限制了核转运。这两个因素共同导致了HAT转运到细胞核的双相调节，这一点在具有动态可调刚度的基质上得到了直接证明。
研究结果进一步揭示了基质刚度如何通过调节染色质可及性和组蛋白乙酰化来影响iN转换。ATAC-seq结果显示，与1 kPa和玻璃基质相比，中等刚度(20 kPa)增加了多个基因组位点的染色质可及性。此外，尽管中等基质刚度(20 kPa)可能降低了某些区域的可及性，但与软基质相比，其对染色质可及性的降低较少。通过将ATAC-seq结果与先前发表的Ascl1染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据整合，发现软基质(20和1 kPa)增加了Ascl1靶基因的基因组区域的可及性；与1 kPa和硬基质相比，中等刚度(20 kPa)在这些神经基因的启动子区域具有最高的可及性。
在基因表达方面，不同刚度基质上的细胞显示出可区分的基因表达模式。中等刚度(20 kPa)促进了与突触组织和轴突生成相关的基因，这在玻璃或1 kPa样本中并不明显。硬基质(玻璃)增强了细胞周期基因和与肌动蛋白相关的基因。值得注意的是，这些基因表达的变化可能与 euchromatin 中基因的调控有关，可能并不归因于表观遗传变化。当引入BAM时，基因表达的变化和表观遗传变化可能共同促进重编程过程。
研究还发现，组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化和DNA甲基化等表观遗传修饰调节染色质可及性，在细胞重编程中起重要作用。通过免疫染色检测非转导成纤维细胞中的组蛋白H3乙酰化(AcH3)、组蛋白H4乙酰化(AcH4)、乙酰化组蛋白H3赖氨酸-27(H3K27ac)和三甲基化组蛋白H3赖氨酸-4(H3K4me3)，以及异染色质标记三甲基化组蛋白H3赖氨酸-9(H3K9me3)、三甲基化组蛋白H3赖氨酸-27(H3K27me3)和三甲基化组蛋白H4赖氨酸-20(H4K20me3)。结果显示，中等刚度(20 kPa)诱导了更高的AcH3和AcH4水平，与更硬和更软的基质相比。这些结果表明，中等刚度可能通过AcH3诱导更开放的染色质结构，从而促进细胞重编程。
为了确定是否存在AcH3在神经基因启动子区域的增加，进行了ChIP-qPCR分析，发现在20 kPa表面上的细胞中，Ascl1和Tubb3的启动子区域AcH3增加，表明中等基质刚度可以通过调节特定位点的表观遗传变化来促进神经基因表达。
研究还探讨了HAT活性在不同基质刚度下的变化，发现中等刚度增加了HAT活性，而HDAC活性随着基质刚度的降低而增加。此外，玻璃培养的成纤维细胞的DNA甲基化水平显著高于在不同刚度PAAm水凝胶上培养的细胞。使用化学抑制剂测试这些表观遗传调节因子对iN转换的相对贡献，发现抑制HAT活性可以抑制HAT活性的双相增强和重编程效率，而抑制HDAC活性对硬基质(40 kPa)和玻璃上培养的成纤维细胞的HAT活性和iN转换效率只有轻微影响。
研究结果表明，通过肌动蛋白聚合介导的基质刚度对HAT转运入核的影响。为了确定肌动蛋白是否在中等刚度介导的HAT活性中起作用，共染色了HAT1与F-肌动蛋白和β-肌动蛋白。结果显示，软基质培养的细胞肌动蛋白聚合较少，HAT1和β-肌动蛋白在20 kPa基质上培养的细胞核中共定位更为明显，表明基质刚度调节了肌动蛋白和HAT1的核转运。Western blot分析G-肌动蛋白和F-肌动蛋白含量显示，随着基质刚度的增加，F-肌动蛋白减少，而G-肌动蛋白则相反，这可能使得软基质上有更多的肌动蛋白单体可用于核转运。进一步的分析表明，β-肌动蛋白和HAT1在20 kPa基质培养的细胞核分数中显著高于其他基质，但在整个细胞水平上并未显示出显著变化。这一发现可能扩展到HAT1之外，因为中等刚度(20 kPa)也促进了p300/CBP相关因子(PCAF)等其他HAT进入细胞核，与软和硬基质相比。
研究还探讨了cofilin作为肌动蛋白/HAT转运入核的共转运蛋白的作用。cofilin是一种肌动蛋白结合和解聚蛋白，具有核定位信号(NLS)结构域，需要通过importin-9将肌动蛋白转运入核。cofilin表达和定位通过免疫染色和Western blot分析确定。结果显示，与肌动蛋白和HAT1一致，cofilin在中等刚度(20 kPa)基质上的细胞核中定位更为明显。此外，当进行肌动蛋白免疫沉淀后分析cofilin时，发现中等基质刚度的细胞核内cofilin-肌动蛋白关联最高，这与核肌动蛋白-HAT1关联和cofilin核定位相一致。由于cofilin磷酸化在Ser3可以抑制cofilin在肌动蛋白解聚期间的活性，进一步分析了不同基质刚度下培养的成纤维细胞中phospho-cofilin(Ser3)水平。Western blot分析显示，随着基质刚度的降低，p-cofilin水平降低，这与F-肌动蛋白随基质刚度降低的结果一致。为了确定cofilin磷酸化是否在调节HAT活性和因此iN重编程中起作用，用BMS-5处理细胞，BMS-5是一种LIM激酶(LIMK)-1/2抑制剂，可抑制LIMK对cofilin的磷酸化。结果显示，用BMS-5预处理显著增加了玻璃和40 kPa基质上成纤维细胞的HAT活性和iN重编程效率，但对20或1 kPa基质上培养的成纤维细胞没有明显差异，因为在没有BMS-5的情况下cofilin磷酸化已经很低。
研究还探讨了基质刚度对cofilin和actin核转运的影响，以及这种转运如何调节HAT活性。使用可调刚度的水凝胶系统直接测定基质硬化如何调节cofilin和HAT1核转运。当基质刚度从2增加到20 kPa时，cofilin和HAT1从细胞质转移到细胞核，HAT活性在基质硬化后6小时显著增加。相反，当基质刚度从20增加到45 kPa时，cofilin和HAT1从核转移到细胞质，HAT活性在表面刚度增加到45 kPa后12小时显著降低。
链接：https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adk0639
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