造血干细胞（HSCs）在体外培养过程中自我更新和分化的平衡问题，这对于维持血液系统的造血稳态和重建受损的造血系统至关重要。由于HSCs的命运受到骨髓微环境的独特调控，设计了模拟骨髓细胞外基质（ECM）网络的可降解支架，通过调节物理参数（如杨氏模量和孔径大小）来研究这些三维（3D）材料特性对造血干祖细胞（HSPCs）命运的影响，以期为3D HSC培养系统的设计提供参数依据。
研究简介
通过设计和制备具有不同杨氏模量和孔径大小的明胶支架，模拟了骨髓ECM网络，并研究了这些生物物理线索如何调控HSPCs的造血功能。研究发现，具有较大孔径（80微米）和较高杨氏模量（70千帕）的支架更有利于HSPCs的增殖和维持干性相关表型。通过体内移植实验，进一步验证了高杨氏模量的支架在维持HSPCs造血功能方面更为有利。这些结果表明，生物物理线索在调节HSC命运中扮演着重要角色，并为3D HSC培养系统的设计铺平了道路。
首先通过流式细胞排序技术从8至12周龄的小鼠中分离出HSPCs，并将其培养在具有不同物理特性的3D明胶支架中。通过扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦荧光显微镜观察，发现大多数细胞在支架中展现出良好的活力，且在大孔径支架中的细胞分布更分散，个体体积更大，而在小孔径支架中的细胞则表现出更强的分化倾向。此外，大孔径支架中更容易观察到HSPCs的聚集，这可能与细胞扩张有关。
为了定量评估这些支架对HSPCs的影响，在培养一周后收集细胞，并使用流式细胞术分析干细胞表面标志物，以评估2D培养和四种3D支架培养得到的干细胞和祖细胞的比例和数量。结果显示，小孔径支架中获得的细胞数量极少，且含有较高比例的分化细胞，而大孔径支架则保留了更高比例的表型干细胞，并最终获得了更多的HSPCs和LKS-SLAM细胞。在材料弹性方面，高弹性（70 kPa）的支架在HSPCs和LKS-SLAM细胞的比例和数量上表现出轻微的优势。
支架的弹性对HSPCs的造血重建功能具有调节作用。通过竞争性移植实验，研究者们评估了不同弹性支架培养的HSPCs的造血功能。结果表明，高弹性支架培养的HSPCs在造血能力上具有优势。此外，通过替换明胶来源和交联剂，制备了不同弹性的支架，进一步验证了高弹性支架在维持HSCs造血功能方面的优势。
在优化支架的研究中，测试了六种不同组合的明胶来源（猪皮、鱼皮和牛骨）和交联剂（GA和EDC）的支架。结果显示，由猪皮明胶和GA交联的支架（GP）在维持HSCs的最大造血功能方面表现最佳。通过初次和二次移植实验，研究者们发现GP支架培养的HSPCs在受体小鼠中保持了高比例的供体嵌合率，表明这些HSCs具有长期自我更新的能力。
尽管3D培养系统在模拟骨髓微环境方面取得了进展，但仍需深入研究支架参数（如弹性和孔径）如何调控HSCs的机制。例如，小孔径支架显著抑制了HSPCs的增殖并促进了大量细胞的分化，这可能是由于密集的空间结构限制了细胞生长的空间，并限制了分泌因子的扩散，导致局部炎症因子（如IL-6）的浓度积累，从而引起过度的细胞分化。未来的研究需要深入探讨这些潜在的调控机制。
在支架材料选择和HSPCs培养过程中去除内毒素的重要性。内毒素，也称为脂多糖（LPS），是革兰氏阴性细菌外膜的组成部分，可以激活多种免疫细胞并引发炎症，因此在血液-材料相互作用的研究中是一个混杂因素和监管挑战。研究中发现，LPS的处理促进了HSPCs的增殖，并伴随着增加的分化，表现为总细胞数量和Lin+细胞比例的增加。然而，LPS处理也增加了表型HSCs的比例和数量，尤其是Sca-1+细胞群体，这使得确定细胞的实际功能和质量变得困难。因此，通过碱煮沸和过滤的方法从明胶中去除了内毒素，以排除内毒素对HSC培养的潜在负面影响。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122111
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