干细胞疗法作为特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF）的潜在治疗方法。IPF是一种常见的、严重的间质性肺病，其特征是肺泡上皮细胞（AECs）损伤，导致成纤维细胞和肌成纤维细胞的激活增加，以及肺泡壁外基质（ECM）的积累。尽管已有药物如Nintedanib和pirfenidone能够减缓疾病进展，但它们并不能显著延长患者的生存时间。因此，正在探索新的方法来增强间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）治疗IPF的疗效。研究拟制造了基于AuPtCoPS三金属的纳米载体（TBNCs），这些载体具有类酶活性和质粒装载能力，旨在有效清除活性氧（ROS），促进治疗基因的传递，并最终提高治疗效果。TBNCs还作为计算机断层扫描（CT）对比剂，用于在治疗过程中跟踪MSCs。
研究简介
本研究的结果表明，通过TBNCs@pDNA基因工程化的hMSCs在抗氧化应激和抗纤维化能力方面表现出显著的增强。首先，TBNCs能够有效地清除移植hMSCs中的ROS，从而增强其在体内的存活率，并将移植hMSCs在体内的寿命延长至14天。其次，TBNCs有效地将HGF pDNA传递到hMSCs中，导致HGF表达水平增加了935倍，最终增强了移植hMSCs的抗纤维化潜力。此外，结合TBNCs强大的CT成像特性和持续表达荧光素酶的hMSCs的生物发光能力，实现了对移植hMSCs在体内分布、迁移和存活的实时监测，这有助于优化MSCs治疗策略，并及时监测其疗效。
在实验中，首先通过控制TBNCs中HAuCl4、H2PtCl6和CoCl2的摩尔比来制备一系列TBNCs，并测试了它们的类酶催化活性。结果显示，不同摩尔比的TBNCs在清除超氧阴离子（•O2−）和过氧化氢（H2O2）的能力上存在差异。通过优化，发现摩尔比为4:4:1的TBNCs展现出最佳的SOD和CAT活性。透射电子显微镜（HRTEM）和元素映射图像揭示了TBNCs的球形形状和均匀合金性质，以及PS复合物中磷（P）和硫（S）的存在，表明TBNCs成功地在蛋白质基质中形成。
进一步的实验中，评估了TBNCs的pDNA装载效率和CT成像性能。通过琼脂糖凝胶电泳筛选TBNCs与pDNA的比例，发现当TBNCs与pDNA的质量比达到12:1时，pDNA的带完全消失，表明TBNCs对pDNA的最佳装载能力。此外，TBNCs@pDNA复合物的表面电荷从47 mV降低到22 mV，水合粒径从59 nm增加到170 nm。使用高分辨率微CT系统评估了TBNCs@pDNA的CT成像性能，结果显示随着TBNCs@pDNA浓度的增加，CT图像的亮度逐渐增强，衰减值与TBNCs@pDNA含量呈线性相关。
在细胞实验中，发现TBNCs@pDNA能够标记hMSCs，并且荧光强度随着TBNCs@pDNA浓度的增加而增加。通过活/死染色试剂盒评估TBNCs@pDNA对hMSCs功能的影响，结果显示即使在100 μg/ml的浓度下，细胞活性也保持在90%以上。此外，TBNCs@pDNA标记的细胞增殖潜力未受显著影响，表明其能够保持hMSCs的干细胞特性。
研究还评估了TBNCs@pDNA在基因传递效率和体外CT成像方面的能力。hMSCs在无血清环境中与TBNCs@pDNA共培养，通过激光共聚焦显微镜观察到EGFP的绿色荧光，表明HGF pDNA被细胞有效内化并整合到细胞核中以促进基因表达。免疫荧光技术进一步证实了HGF的成功表达。通过逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）对HGF表达水平进行了定量分析，发现标记的hMSCs中HGF的表达水平是不标记hMSCs的935倍。
在抗氧化应激能力的评估中，使用H2O2诱导的氧化应激细胞模型来评估TBNCs清除细胞内ROS的效率。结果显示，TBNCs标记的hMSCs在ROS攻击后，线粒体结构保持相对完整，而未标记的hMSCs线粒体结构受到显著损害。流式细胞术分析表明，TBNCs@pDNA能够显著降低hMSCs的晚期凋亡和坏死比例。
在体外治疗效果的评估中，发现TBNCs@pDNA标记的hMSCs能够促进受损AECs的修复，并抑制AECs向肌成纤维细胞的转化。此外，TBNCs@pDNA标记的hMSCs还能够诱导肌成纤维细胞的凋亡，并通过ELISA测量MMP-2和MMP-9的表达水平，发现标记的hMSC-CM导致肌成纤维细胞培养上清中活性MMP-2和MMP-9水平升高。
在体内双模态成像追踪标记的hMSCs方面，通过慢病毒转染建立了持续表达荧光素酶报告基因的hMSCs（hMSCsluc），并与TBNCs@pDNA共培养以获得标记的hMSCsluc。在IPF小鼠模型中，通过IVIS Lumina II系统实时监测移植hMSCs的存活状态，并使用CT成像观察移植hMSCs的生物学行为。结果表明，标记的hMSCs在IPF小鼠体内存活时间显著延长，并且能够在CT成像中清晰地观察到hMSCs的分布和迁移。
最后，在体内治疗效果的评估中，发现标记的hMSCs在IPF小鼠肺部显著表达HGF，并且能够显著降低肺纤维化标志物α-SMA和Col I的表达水平。此外，通过TUNEL染色评估肌成纤维细胞的凋亡，发现标记的hMSCs移植组中凋亡的肌成纤维细胞数量显著增加。微CT成像和病理分析显示，与BLM组相比，标记的hMSCs治疗组小鼠肺组织结构的保存更好，正常通气区域显著增加。
链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adq0703
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