研究领域普遍认为CAR-T细胞在实体瘤治疗中面临的三大障碍包括：CAR-T细胞在实体瘤中的迁移和渗透、在抑制性肿瘤微环境中的持久性和功能，以及寻找能够促进肿瘤根除同时保护周围健康组织的合适肿瘤抗原。在结直肠癌（CRC）的背景下，已有研究表明，通过细胞毒性T细胞可以控制由结肠产生的转移性病变。
研究团队识别了鸟苷酸环化酶C（GUCY2C）作为肠道上皮内的一种可以被免疫疗法靶向的粘膜抗原。GUCY2C是一种颗粒环化酶，被鉴定为大肠杆菌热稳定肠毒素ST的受体，该毒素是导致腹泻疾病的原因。GUCY2C在CRC中的环化酶活性虽被沉默，但在超过95%的病例中维持受体表达。包括疫苗、抗体药物偶联物、双特异性T细胞引导剂和CAR-T细胞在内的免疫治疗方式已在动物模型中显示出对GUCY2C表达的转移性病变的控制或消除效果。GUCY2C在GUCY2C导向的合成CAR-T细胞疗法的小鼠模型中也被证明是安全靶点，并且没有因靶向治疗而产生的毒性。在针对GUCY2C的腺病毒癌症疫苗的临床试验中，没有报告比1级更严重的不良事件，这表明针对GUCY2C的T细胞不会引起肠道结肠炎。
CARs的一般设计自其诞生以来相对均一，由以下三部分组成：(1) 抗原靶向域，通常源自抗体并组织成一个称为单链可变片段（scFv）的单一分子框架，(2) 结构域，包括一个灵活的分子铰链和跨膜域（HTM），以及(3) 来源于定位于免疫突触部位的T细胞蛋白的细胞内信号域（ICDs）。在CAR设计中，scFv的变化最大，这是由于不同的抗原靶向目标，其次是ICDs，它们主要由CD3ζ、CD28和4-1BB组成。变化最少且在CAR功效中作用最不明确的区域是结构域。最常使用的域来自CD8α或CD28，但也使用了源自IgG4的其他域。本研究在识别了针对GUCY2C的人类scFv并使用CD28、4-1BB和CD3ζ（28Bζ）ICD设计进行了小鼠研究后，进一步探讨了先前被忽视的结构域，这些域源自CD8α或CD28，是否对CAR的疗效和CAR-T细胞表型有影响。研究设计了两种CAR，分别称为CD8HTM和CD28HTM，它们只在结构域上有所不同，并评估了这两种受体在体外和体内治疗转移性CRC的表现。
图1展示了CD8HTM和CD28HTM两种结构域对CAR-T细胞生产参数的影响。图1a显示了两种CAR的设计，包括EF1α启动子、CD8α或CD28的铰链和跨膜结构域（HTM）、抗GUCY2C的单链可变片段（scFv）、CD28、4-1BB和CD3ζ的细胞内信号域（ICDs），以及T2A自切割肽和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。图1b和1c分别展示了CD8HTM和CD28HTM CAR-T细胞在体外扩增12天后的扩增倍数和活力，结果表明两种结构域对CAR-T细胞的扩增和活力没有影响。图1d通过流式细胞术分析了CAR转导的T细胞中CD8+和CD4+亚群的比例，发现结构域对这些亚群的扩增没有影响。图1e和1f进一步比较了两种CAR在CD8+和CD4+ T细胞中的转导效率（GFP+百分比）和构建体表达水平（GFP MFI），发现CD4+ T细胞在两种CAR中都有更高的GFP+细胞百分比和GFP表达水平。图1g和1h显示了CD8+和CD4+ T细胞在两种CAR中的转导效率和构建体表达水平的比较，而图1i则展示了CD8HTM和CD28HTM CAR在CD8+和CD4+ T细胞中的构建体表达水平的等效性。这些结果表明，尽管CD4+ T细胞在两种CAR中显示出更高的转导效率，但CD8HTM和CD28HTM CAR在构建体表达上是等效的。
图2展示了CD8HTM和CD28HTM两种结构域对CAR-T细胞表型的影响，这些表型与抗原无关。图2a显示了CD8+和CD4+ CAR-T细胞中四种主要记忆细胞表型（效应细胞、效应记忆细胞、中央记忆细胞和初始/干细胞记忆样细胞）的分布，结果表明两种结构域在这些表型上没有显著差异。图2b通过展示SPICE图，比较了两种CAR-T细胞中0到4个耗竭标志物的表达情况，发现大多数细胞不表达任何耗竭标志物，且在表达至少一个耗竭标志物的细胞中，CD39是主要的标志物。在CD8+和CD4+ T细胞群体中，CD8HTM和CD28HTM CAR-T细胞的CD39总表达量没有显著差异。这些结果表明，尽管CAR的scFv和ICDs成分可能影响记忆表型和耗竭，但结构域本身并不影响抗原非依赖性的T细胞表型。
图3展示了CD8HTM和CD28HTM两种结构域的CAR-T细胞表面CAR表达水平的比较。图3a和3b使用蛋白L（Protein L）来测量CAR表面水平，蛋白L能够与抗体的kappa轻链结合，从而提供了一种与抗原无关的方法来检测CAR，结果显示CD8+和CD4+ T细胞中CD8HTM和CD28HTM CAR的水平相当。图3c和3d通过抗G4S抗体进一步确认了CD8+和CD4+ T细胞表面的CD8HTM和CD28HTM CAR的表达量，G4S抗体通过与scFv中的(G4S)4柔性连接子结合来识别T细胞表面的CAR分子。图3e和3f量化了每个T细胞表面的CAR分子数量，发现CD8+和CD4+ T细胞中CD8HTM和CD28HTM CAR的水平相似。此外，由于CD4+ T细胞的GFP阳性细胞百分比和MFI高于匹配的CD8+ T细胞，预期CD4+ T细胞表面会有更多CAR，这与观察结果一致。CD8+ T细胞的平均CAR分子数为3906，而CD4+ T细胞为10,365，无论CAR设计如何，这一差异具有统计学意义。这些结果表明，尽管CD4+ T细胞表面上的CAR数量更多，但两种结构域的CAR在CD8+和CD4+ T细胞中的表达水平是相当的。
图4展示了CD8HTM和CD28HTM两种结构域的CAR-T细胞对GUCY2C抗原的结合能力。图4a显示了CD8+和CD4+ T细胞与不同浓度的GUCY2C抗原结合的流式细胞术直方图，比较了CD8HTM和CD28HTM CARs的结合情况。图4b通过非线性回归模型分析了两种CAR-T细胞的结合亲和力和EC50值，结果显示CD8HTM CAR具有更高的GUCY2C抗原结合亲和力，其EC50值为7.78–8.26 nM，而CD28HTM CAR的EC50值为11.3–13.0 nM。图4c在饱和配体浓度下展示了两种CAR-T细胞的总受体占有率（Bmax），发现两者相似，这与之前使用抗原非依赖性检测方法的结果一致，表明T细胞表面表达的CAR分子数量相当。图4d进一步比较了同一CAR设计中CD8+和CD4+ T细胞群体的结合亲和力，发现两种T细胞群体之间没有差异。这些结果表明，是结构域本身而不是CAR受体的数量或T细胞共受体亚群的固有差异，导致了抗原结合亲和力的差异。
图5展示了CD8HTM和CD28HTM两种结构域的CAR-T细胞在抗原刺激下产生效应细胞因子的能力。图5a和5d显示了CD8+和CD4+ T细胞在CD8HTM和CD28HTM CAR-T细胞中产生0到3种细胞因子的百分比，结果表明CD8HTM CAR-T细胞在刺激后产生细胞因子的能力显著高于CD28HTM CAR-T细胞。图5b和5e通过SPICE图展示了CD8+和CD4+ CAR-T细胞中细胞因子的平均数量和类型，表明两种CAR-T细胞的多功能性相当。图5c和5f比较了两种CAR-T细胞中TNFα、IL-2和IFNγ的产生情况，发现CD8HTM CAR-T细胞在产生IL-2和IFNγ方面显著高于CD28HTM CAR-T细胞。此外，图5g和5h展示了在抗原刺激后，CD8+和CD4+ CAR-T细胞中颗粒酶B（granzyme B）的产生情况，结果显示CD8HTM CAR-T细胞产生的颗粒酶B显著多于CD28HTM CAR-T细胞。这些结果表明，CD8HTM CAR-T细胞在抗原暴露后具有更高的效应细胞因子产生水平和细胞毒性潜力。
图6展示了CD8HTM和CD28HTM两种结构域的CAR-T细胞在体外对不同GUCY2C表达水平的结直肠癌细胞系的杀伤能力。图6a和6b通过RT-PCR和Western blot分析分别展示了SW620、LoVo、LS174T和T84细胞系中GUCY2C mRNA和蛋白的表达水平。图6c显示，在高表达GUCY2C的T84细胞中，两种CAR-T细胞的杀伤能力没有显著差异，都能在12小时内杀死大部分细胞，且达到80%杀伤所需时间（KT80）相似。图6d在中等表达GUCY2C的LS174T细胞中，CD8HTM CAR-T细胞表现出更快的杀伤速度，尽管在统计上差异不显著。图6e在低表达GUCY2C的LoVo细胞中，CD8HTM CAR-T细胞的杀伤能力显著优于CD28HTM CAR-T细胞。图6f展示了KT80与GUCY2C蛋白水平之间的相关性，以及在抗原密度降低时CD8HTM和CD28HTM CAR-T细胞杀伤能力差异的增加。这些结果表明，CD8HTM CAR-T细胞在低表达GUCY2C的肿瘤细胞中具有更好的杀伤效果，这与其更高的抗原亲和力有关。
图7展示了CD8HTM和CD28HTM两种结构域的CAR-T细胞在体内对肿瘤的治疗效果。图7a描述了实验设计，其中T84细胞被改造以表达Click Beetle Red荧光素酶和mCherry荧光报告基因。在NOD-scid-gamma MHC I/II双敲除（NSG-MHC I/II DKO）小鼠中建立腹膜转移模型，并通过生物发光成像技术评估肿瘤负担。图7b显示了治疗前CD8HTM和CD28HTM组的肿瘤负担比较，两组在治疗前肿瘤负担相当。图7c和7d展示了治疗后不同时间点的生物发光图像和肿瘤负担的中位数及个体比较，表明CD8HTM CAR-T细胞在减少肿瘤信号方面比CD28HTM CAR-T细胞更有效。图7e通过Kaplan-Meier曲线展示了两组CAR-T细胞治疗后肿瘤清除的时间，CD8HTM治疗组有70.6%的小鼠实现了肿瘤清除，而CD28HTM治疗组仅有11.8%。这些数据证明了源自CD8α分子的铰链和跨膜结构域在抗GUCY2C CAR-T细胞疗法中具有更优越的抗肿瘤效果。
本研究深入探讨了CD8HTM和CD28HTM两种不同结构域的CAR-T细胞在实体瘤免疫治疗中的效能。研究发现，尽管两种CAR-T细胞在表面CAR表达、T细胞亚群扩增和活化表型上没有显著差异，但CD8HTM CAR-T细胞在结合GUCY2C抗原时表现出更高的亲和力，这使得它们在体外实验中对低抗原表达的肿瘤细胞具有更强的杀伤能力。CD8HTM CAR-T细胞在受到抗原刺激后能产生更高水平的效应细胞因子，如IL-2和IFNγ，以及更多的细胞毒性分子颗粒酶B。在体内实验中，CD8HTM CAR-T细胞在高抗原表达的肿瘤模型中显示出更强大的抗肿瘤效果，肿瘤清除率显著高于CD28HTM CAR-T细胞。这些结果表明，CD8HTM结构域可能在设计针对实体瘤的CAR-T细胞疗法时提供更优的临床效果。
