大家提到肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4），一定会反应性的想起中性粒细胞外陷阱（NETs）吧！（国自然热点|研究中性粒细胞的7个方向，推荐给2025申请人！）没错，就是针对这一传统的观念，是否存在一种可能，提到了PAD4就会联想到其他的机制呢？也正是这一想法，使一篇文章发在了IF 21.8的期刊上。
在这里小编就同大家来看一篇海军军医大学联合中国科学技术大学等团队发表在Cellular & Molecular lmmunology杂志上的文章，看看PAD4除了与NETs联系起来，还能做些什么。
图1：文章来源（Cellular & Molecular lmmunology）
主要研究内容
本文通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和底物瓜氨酸化图谱分析，发现肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）（关键分子）的缺失能够减轻炎性肠病（IBD）（目标疾病）小鼠模型的症状。
其中，中性粒细胞（主要细胞1）来源的细胞外囊泡（EVs）（细胞间的联系者）将PAD4传递到肠上皮细胞（IECs）（主要细胞2），在IECs内PAD4瓜氨酸化CKMT1的R242位点，导致CKMT1蛋白稳定性降低，并通过自噬途径降解（具体机制通路）。
这种降解作用损害了线粒体稳态，破坏了肠道屏障的完整性，并诱导了IECs的凋亡。
科学问题
1、作者如何想到在IBD中将PAD作为主要研究分子的？又是怎么去验证PAD在IBD中作用的？
图2：PAD4缺乏可减轻IBD症并重塑肠道细胞
2、如何发现PAD4的关键靶标CKMT1的？
3、作者是如何将PAD4、瓜氨酸化和 CKMT1 相关联起来的？
进一步的通过瓜氨酸化位点分析，发现CKMT1的R242位点（小鼠中为R243）是PAD4介导的瓜氨酸化的靶点。转染含有R242K突变体CKMT1（阻止瓜氨酸化）的质粒到HEK293T细胞中，然后用ionomycin处理的WT和PAD4−/− PMNs的上清液刺激这些细胞，发现CKMT1的瓜氨酸化水平显著增加，但在PAD4缺失或R242K突变体中被阻断。（一个KO小鼠，一个是关键位点突变，都证实了与CKMT1联系的不可或缺）。
进一步作者使用自噬-溶酶体抑制剂（如chloroquine和3-MA）处理细胞后，CKMT1蛋白水平显著增加，而蛋白酶体抑制剂MG132没有显著影响，表明瓜氨酸化可能通过自噬途径调节CKMT1蛋白的稳定性。
图3：PAD4 在 IEC 中对 CKMT1 的 R243 进行瓜氨酸化并促进其降解
关键实验技术
本文为了验证蛋白质位点的瓜氨酸化，主要涉及一下两种关键技术：
其余的技术就是本文的一开始涉及了scRNA-seq，通过PCR和WB检测了分子、蛋白的表达量，通过流式分析明确了细胞表面标志物的表达和细胞群落的组成，用ELISA检测了上清中特定蛋白或细胞因子的水平，并且用了KO的动物模型和细胞转染来验证关键基因的功能。
研究亮点
1、醉翁之意不在酒
本文入手的是NETs中的关键酶PAD4，但是本文在IBD的研究中，不落俗套，并没有一股脑的钻进NETs相关的研究中，而是另辟蹊径，发现了IBD中的另一大机制，即PAD4通过EVs被转运到肠上皮细胞（IECs）中，直接参与IECs的功能调控。打破了大家一提到PAD4就一定要联系到NETs的传统观念。
2、发现PAD4的关键靶点
文章揭示了PAD4对CKMT1的瓜氨酸化导致CKMT1蛋白稳定性降低，并通过自噬途径促进其降解。这一发现把PAD4的下游靶点挖掘出来，有利于在该方面进行拓展研究，对于之前机制考虑为NETs相关的研究，也可以看一看与CKMT1之间是否存在有关联。
思路拓展
在这里，小编找到了一篇有关幽门螺杆菌（H. pylori）感染如何通过影响PAD4的表达来加剧类风湿性关节炎（RA）的进展的文章，看看这篇文章又是如何研究PAD4的。
图4：文章来源（Pubmed）
首先，作者发现感染H. pylori的RA患者表现出更高的疾病活动度评分（DAS-28）和抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）水平，暗示了H. pylori感染与RA的严重程度密切相关（与上文不同的是，本文先引出的是ACPA而非PAD4，其实也是可以理解的，因为这类抗体是风湿性疾病中很常见的）。
随后，作者通过scRNA-seq、免疫共沉淀、质谱分析和酶联免疫吸附测定等，揭示了H. pylori感染能够通过活性氧（ROS）/缺氧诱导因子1α（HIF-1α）信号通路，上调PAD4的表达。为什么又能联系到PAD4呢？
实际上PAD4是一种关键的瓜氨酸化酶，能够催化特定蛋白的瓜氨酸化，从而改变其功能。因此，本文再将两个大家都认可的点结合起来：ROS/HIF-1α信号通路和关键的瓜氨酸化酶PAD4联系起来，最终本文就为理解H. pylori感染如何影响RA的病理过程提供了新的分子机制，最终也发表在不错的杂志上。
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