New Phytolo. | 禾本科‘芒’反复出现背后的演化机制

图1：芒在早熟禾亚科（Pooideae）中经历了多次的获得、丢失和重新获得

芒的功能与其形态密切相关。例如，带倒刺的芒可能通过动物传播，而羽毛状的芒可能通过风传播。扭曲的膝状芒，其近端带有扭曲柱和膝状弯曲，通常具有吸湿性，可通过扭转和反扭转使草籽在地表移动。这种运动可能增加种子扩散距离，并通过将种子埋得更深来促进幼苗的建立。大麦和小麦的芒能进行光合作用，为正在发育的种子提供光合产物。因此，带芒的大麦和小麦品系相比无芒品系具有更少但更重的谷粒。这些更重的种子中额外的养分可能有助于幼苗的建立。此外，芒还与防止食草动物取食、调节冠层温度和影响种子脱落有关。因此，带芒外稃的形态和功能已经表现出显著的分化。

尽管形态和功能多样化，所有外稃都是叶的同源结构。禾本科叶片沿从近下往上分为三个部分：叶鞘、叶舌和叶片。在带芒外稃中，芒可能与叶片部分同源。因此，推测无芒外稃可能失去了叶片部分。

形态性状的丢失通常与基因丢失相关。然而，在芒的进化中，基因丢失的可能性较低。基因丢失与洞穴鱼的无眼性状、水生植物的无根性以及不能爬行的真菌细胞的进化有关。但与这些情况相反，芒的丢失是可逆的：在禾本科植物进化过程中，芒多次获得、丢失并重新获得。此外，许多禾本科植物虽然外稃无芒，但其营养叶片仍具有典型的叶片结构，例如玉米（Zea mays）、许多栽培稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）和小麦（Triticum aestivum）品种。这些数据表明，即使芒不存在，调控叶片（和芒）发育的基因仍保留在禾本科植物的基因组中。

在无芒物种中保留叶片发育程序可能提供了一种遗传物质储备，在适当条件下可以被激活，生成供选择作用的表型变异。我们假设，芒是通过外稃中叶片发育程序的反复激活和抑制而获得或丢失的。在这一假设下，发育限制不会减少表型变异，而是会增强其出现的可能性。

为验证这一假设，我们研究了禾本科植物中芒的进化历史，重点关注包含遗传实验的模式物种二穗短柄草以及大麦、燕麦和小麦等作物在内的早熟禾亚科（Pooideae）支系。我们评估了假设背后的两个预测。具体来说，如果一个保守的发育程序支持芒的反复进化，我们预测独立衍生的芒和叶片会具有：（1）保守的发育轨迹；（2）调控其发育的保守基因。通过解剖学、形态学、发育学和遗传学的比较分析，我们揭示了支持芒的反复进化以及芒多样性进化的保守发育机制。

图2：芒的形态在早熟禾亚科中具有复杂的进化历史

为研究芒的进化历史并识别独立出现的芒以供进一步研究，我们重建了早熟禾亚科中外稃芒的最可能祖先状态。我们将芒的存在情况映射到一个时间校准的系统树上，其中包含该亚科约10%的物种。在较深的节点上，重建结果具有不确定性，预测所有早熟禾亚科物种的共同祖先同样可能具有带芒和无芒外稃。然而，在较浅的节点上，我们预测了多次芒的获得和丢失。芒在早熟禾亚科中获得的频率约为丢失的两倍（本研究中41次获得，22次丢失；图1d,e；表S2,S3）。芒的获得和丢失同时发生在属内（27次属内获得和15次属内丢失）以及较大分支的分化之前（通向包含多个属的分支的5次获得和7次丢失）。由于我们使用的系统树仅包含早熟禾亚科中一小部分物种，这些转变次数可能被低估了。

为确定芒的出现和消失是否随机发生，我们使用D统计量估算了芒存在的系统发育信号。系统发育信号估计表明，性状在近缘物种间的相似性，而非在系统树上随机进化。D统计量估计值为0.2667，表明芒的存在并非随机进化（P = 0）。因此，芒在早熟禾亚科中的进化是一种可变但非随机的过程。

为评估芒形态在早熟禾亚科中的变化，我们分析了芒的形态、长度和着生位置（图2a，S1，S2）。数据集中的大多数物种表现出以下三种形态中的一种：（1）无芒，（2）扭曲膝状芒，（3）直芒（图2a,b）。卷曲或分枝芒仅出现在Streblochaete longiarista及某些外群物种中。如同芒的存在情况，较深节点的性状状态不确定，但较浅的内节点显示出明确的模式。例如，小麦超族（包含小麦及其近缘种的小麦族、燕麦族和Littledaleeae）的超级分支；仅具有直芒。相较而言，其他大型族（早熟禾族、燕麦族和针茅族）则包含各种芒类型的混合。最长的芒仅存在于针茅族以及小麦、大麦及其近缘种（图S1），例如在Nassella tenuissima（针茅族）中，芒长度可达外稃本体长度的25倍。在早熟禾亚科的这一子集中，芒的平均长度约为外稃长度的3.6倍，仅31%的带芒物种的芒长度小于或等于其外稃本体长度。芒在臭草族（Meliceae）、早熟禾族（Poeae）、燕麦族（Aveneae）族的物种以及一个小麦族物种中表现为背面桌生（图S2）。直芒很少转变为扭曲膝状芒，但扭曲膝状芒常转变为直芒。此外，扭曲膝状芒从无芒状态进化的频率几乎与直芒相同（图2b）。

我们接着在代表两到三次独立芒衍生的六种早熟禾亚科物种中研究了芒的解剖结构和微形态（图3a,b）。首先，大穗看麦娘中的芒独立于其他五个物种的芒而衍生（图1d，节点3）。其次，小麦超族物种（如小麦、大麦、黑麦和旱雀麦）共享一次衍生事件（图1d，节点1）。第三，短柄草属中的芒可能独立于小麦超族而衍生（图1d，节点2）。这些物种的芒在角质蜡（cuticular wax）形成和皮刺密度（prickle density）上表现出差异（图3a）。在横切面中，所有直芒都由许多小细胞组成，而大穗看麦娘的扭曲膝状芒由少量大的细胞组成，且只有两层细胞围绕中央维管束（图3b）。因此，芒的形态、解剖和微形态在早熟禾亚科中表现出差异，表明独立衍生的芒在早熟禾亚科中具有多样化的功能。

图3：早熟禾亚科中的芒在解剖结构和功能上存在差异

我们进一步研究了短柄草的芒与普通小麦或大麦的芒之间功能是否具有保守性。短柄草、大麦和小麦的芒均为直芒，具有类似的细胞类型和组织结构，包括在芒的背面（腹面）沿轴排列的气孔和叶肉组织，表明其具有光合作用能力（图3a）。然而，短柄草的芒明显比小麦和大麦的芒短，并且叶肉组织较少。短柄草的芒可能独立于小麦和大麦的芒进化而来（图3b、S1、S2）。多项独立研究表明，小麦和大麦的芒通过为发育中的籽粒提供光合产物（光合物质）来促进籽粒质量。为了确定短柄草的芒是否具有类似的促进籽粒填充的作用，我们进行了芒去除实验。

在两次独立实验中，我们分别进行以下处理：(1) 去除所有芒，(2) 从发育中的小穗上移除一个颖片（作为伤口控制处理），或 (3) 植株不作处理。结果显示，在两次实验中，实验组和对照组植株的平均籽粒质量相似（实验1：P = 0.144；实验2：P = 0.332，单因素方差分析；图3c；表S4、S5）。功效分析表明，每组样本量为279（实验2）或587（实验1）粒籽即可检测到4%的平均籽粒质量变化（Cohen's d = 0.29，α = 0.01，功效 = 80%），这一变化幅度位于小麦实验中观察到的最低范围。我们的芒去除实验每组测量的籽粒数量为629-1213粒（表S5），远高于最低需求量。同样，去除芒并未对每小穗籽粒数目产生影响（图3d）。在实验1中，去除颖片的植株每小穗籽粒数显著低于去除芒的植株（P = 0.916），但在实验2中这一差异具有显著性（P = 0.005，单因素方差分析）。功效分析估算，每组至少需要11个（实验1）或14个（实验2）小穗才能检测到超过未处理植株变异范围的籽粒数差异（Cohen's d = 1.41，α = 0.01，功效 = 80%）。我们的芒去除实验中，每组测量的小穗数量为153-393（表S5），显著高于估算的最低需求量。因此，进一步扩大实验规模也可能无法揭示短柄草芒在籽粒填充中的功能。短柄草的芒比小麦和大麦的芒更短、更窄（图3b、S1），这可能限制其在籽粒填充中的潜力。然而，在其他物种中，芒可能在干旱胁迫下对籽粒填充具有特殊作用。在干旱条件下，短柄草芒在籽粒填充中的功能可能会得以显现。

如果蛰伏的叶片发育程序是多次进化出带芒外稃的基础，那么我们可以预期带芒外稃的发育会遵循典型的禾本科叶片发育模式。在禾本科植物的叶片中，叶的叶片（blade）和叶鞘（sheath）部分都会在早期发育中同时形成，但叶片部分会率先扩展，叶鞘部分则在叶舌（ligule）形成的同时稍后开始扩展。为了评估带芒外稃是否遵循这一模式，我们追踪了三种独立进化出芒的植物的芒发育过程（图1d），这些植物的芒形态各异，包括短柄草（直芒）、大穗看麦娘（芒在外稃背面近基部插入，呈扭曲膝曲状）、以及绒毛草（芒在外稃背面近顶部插入，亦呈扭曲膝曲状）。由于绒毛草的芒直径小于100 μm，长度约2 mm，且花序样本有限，因此未纳入解剖学分析。

在短柄草中，外稃原基很早就出现，位于花序分生组织下方，顶端呈尖状。该尖端逐渐延长形成芒，每个新生成的芒都比位于下方外稃上的更老的芒稍短（图4a, b）。芒的延长早于雄蕊原基的形成，且在从顶端到基部逐渐分化出皮刺（图4b）。芒的着生点近端的外稃部分在发育后期（当心皮开始分化时）才延展（图4c）。成熟的短柄草外稃在芒的着生点远端没有可见的外稃部分（图4c, d）。

图4：具有独立起源的芒的三种物种共享相似的发育轨迹

绒毛草的外稃原基同样在早期出现，且顶端呈尖状（图4e）。绒毛草的小穗仅有一朵具芒花（图4i）。外稃在花器官发育的同时扩展，尖端和外稃下部组织同时扩展（图4f）。随后，随着雄蕊继续发育，芒开始延伸并产生皮刺，而芒着生点远端的外稃部分也开始延展（图4g）。与短柄草类似，芒着生点近端的外稃部分构成了外稃的主体部分（图4h）。

在看麦娘中，外稃原基在花发育早期出现，顶端呈尖状，在形态上与短柄草和绒毛草的芒非常相似（图4j）。然而，与短柄草和绒毛草不同，看麦娘的外稃发育在初始模式形成后暂停，同时内层花器官开始分化（图4k, l）。直到花药开始形成花粉囊时，芒才开始延伸（图4m, n）。芒延伸后，芒着生点远端的外稃组织开始出现并延展（图4o–q）。成熟时，芒着生在外稃的近基部，芒着生点下方的外稃部分延展最少（图4r）。如果芒确实与叶的叶片部分同源，而具芒外稃的基部与叶鞘同源，那么根据位置推测，芒着生点远端的外稃部分可能与叶舌同源。在这种情况下，看麦娘外稃的大部分主体可能由叶舌组织构成，这一假设需要进一步探索。

尽管在形态上有所不同，这些物种在以下发育轨迹上具有共性：(1) 外稃基部和芒的起始；(2) 芒的延伸和分化；(3) 外稃基部的后期延展（如短柄草和绒毛草），以及芒着生点远端部分的后期延展（若存在，如看麦娘和绒毛草）。这一轨迹类似于禾本科植物叶片发育模式：叶鞘和叶片先形成，接着叶片延展和分化，最后叶鞘和叶舌延展和分化。此外，所研究的三种植物的具芒外稃在早期发育中形态极为相似（图4a, e, j），但在后续发育过程中形态有所分化。独立进化出芒的物种在早期发育模式和发育轨迹上的共性，尽管其成年形态不同，表明这三种植物可能共享一种类似的发育程序。

如果芒的反复进化源于发育过程的保守性，那么我们可以预期其独立进化的芒会由保守的遗传通路调控。为验证这一假设，我们研究了 YABBY 转录因子基因 DROOPING LEAF (DL)的功能。该基因在水稻和大麦中调控芒的发育，同时还调控水稻和玉米的心皮和叶片中脉的发育。

我们首先对短柄草中的一个现有突变体awnless1 (awl1)进行了定位和克隆，该突变体的表型类似于其他dl突变体。awl1突变体无芒且缺少叶片中脉（图5a–f）。对awl1突变体进行全基因组测序发现，一段缺失变异与awl1的表型共分离（P = 0.718，卡方检验；图5g，S3）。该缺失区域包含四个基因以及BdDL上游的一段保守的非编码序列。重要的是，利用逆转录定量PCR检测发现，awl1突变体中BdDL的表达无法检测（图5h）。我们使用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术构建了Bddl突变体，表型与awl1突变体的无芒表型一致（图5i）。该突变体为双等位突变体，在第2和第4外显子中有单碱基编辑，预计会导致终止密码子提前出现（图5j）。因此，BdDL是短柄草芒起始所必需的。awl1突变体的无芒表型可能是由于BdDL调控区域的缺失导致Bddl表达减少引起的。

图5：短柄草中的 BdDROOPING LEAF (BdDL) 基因是芒发育所必需的

我们进一步测试了 DL 是否是看麦娘芒的发育必不可少的，使用病毒诱导基因沉默（VIGS）进行研究。看麦娘的扭曲膝曲芒独立于短柄草和水稻的直芒进化而来（图1d）。我们使用 VIGS 技术敲低看麦娘中AmDL（ALOMY6G44958）的表达。看麦娘只有一个DL同源基因，从而降低了脱靶效应的可能性。我们设计了三个针对AmDL mRNA不同区域的构建体，并将含有 230 bp 的 GFP 序列（GenBank: E17099.1）或空多克隆位点（MCS）的构建体作为脱靶效应的阴性对照。尽管我们的 VIGS 构建体与看麦娘基因组中的其他六个 YABBY 基因存在短片段同源，但这些同源片段长度不足以引发沉默效应。因此，我们认为发生脱靶沉默的可能性很低。

靶向AmDL的 VIGS 实验表明芒的起始、长度和位置均发生变化。尽管三个针对AmDL的构建体表现出不同的效率，但它们均导致无芒外稃表型（12/23株植株，共计15个小穗，图6e）。反应最强的两个构建体还导致心皮异常，类似于水稻和玉米中 dl 突变体的表现。所有处理过 GFP 或 MCS（空载体）阴性对照构建体的植株均显示正常的芒发育（24/24株植株；图6a–c，S4）。

图6：大穗看麦娘中的 AmDROOPING LEAF (AmDL) 基因是芒发育所必需的

看麦娘的芒通常着生在外稃基部附近。有趣的是，在超过一半（8/15）具有无芒花的小穗中，受影响小穗上的其他花显示芒较短。在这些花中，芒着生在外稃的中部附近，并与外稃部分融合，而未处理和对照植株中芒通常是独立的（图6e）。这种着生点的变化表明 DL 在沿近端–远端轴分区叶原基方面发挥了作用。这可能提供了一种调控芒着生点的机制，而芒的着生点是一个重要的分类学特征。综合这些结果，表明 DL 在至少三个独立进化的芒发育过程中是必要的（图1d）——水稻、短柄草（图5b）和看麦娘（图6b, c）。DL 的一个同源基因也调控大麦芒的发育，这可能代表芒的第四次独立起源（祖先状态估计尚不确定；图1d）。因此，尽管这些物种中的芒是独立进化的，其形态和功能也各不相同，但 DL 在所有情况下均是芒发育的关键调控因子。

讨论

尽管具有复杂的进化历史和多次独立起源，芒很可能与叶片同源，并共享叶片的发育模式和调控途径。芒在早熟禾亚科（Pooideae）中多次独立进化（图1d）。短柄草、小麦和大麦的芒在维管解剖结构上相似（图3b），但芒的功能可能并不保守。在我们的实验条件下，去除短柄草的芒对所测量的籽粒性状没有影响（图3c）。虽然这些独立起源的芒在形态和假定功能上有所不同，但其发育轨迹彼此相似，并与禾本科植物叶片的发育轨迹相似（图4）。此外，DL对短柄草和看麦娘芒的起始均为必需，并可能在调控芒着生点方面发挥作用（图5, 6）。综上所述，这些数据验证了我们的预测：尽管形式和功能不同，独立起源的芒在以下两方面具有保守性：(1) 发育轨迹，以及 (2) 调控其发育的基因。因此，一种保守的叶片发育程序可能是芒反复进化的基础。

许多反复进化的实例是对特定环境条件的适应，例如水生浮萍科植物的根丧失、大戟属植物的旱生形态、洞穴鱼的眼睛退化、三刺鱼的底栖形态，以及甲虫的下颚形态。例如，在甲虫中，下颚形态与饮食强相关，而与系统发育历史无关。尽管芒可能是同源的，其形态和功能却存在差异，许多芒可能并不具备特定的适应功能。事实上，芒的反复出现未必总是适应性进化的结果。相反，芒的频繁出现可能是发育过程的自然结果，并在某些情况下为自然选择提供了表型变异。

带芒外稃形态的多样性部分可能由外稃不同部位的差异性生长驱动。芒自身比营养叶片窄得多，这表明带芒外稃的侧部和边缘叶组织可能被抑制或缩减，或者某种其他机制导致芒的中-横向生长受到限制。在短柄草中，芒着生点远端没有可见的外稃部分，从而形成了顶端插入的长芒（图4d）。在绒毛草中，芒着生点远端存在一个较小的外稃部分，从而形成了次顶端着生的芒（图4i）。在看麦娘中，芒着生点上方的外稃部分扩展远大于外稃基部，从而形成了背面着生的长芒（图4r）。如果芒着生点远端的外稃部分与叶舌同源，如其位置所暗示的（图1, 4），那么看麦娘外稃的大部分主体可能由叶舌组织构成，尽管这一假设仍需进一步验证。无论同源性如何，外稃不同部位的差异性扩展和分化是驱动这三种植物带芒外稃形态差异的重要因素。这类似于叶片的差异性生长对形态多样性的贡献，或异型花柱报春花的花形态多样性。因此，深度保守的器官发育过程下游的差异性生长可以促成成年阶段形态的多样性。

许多地上器官，包括外稃和心皮等花器官，都是叶片的变异形式。除了在叶片和芒发育中的作用外，DL还调控心皮的发育。短柄草awl1突变体、用BSMV:asAmDL处理的看麦娘、玉米突变体Zmdrl1和Zmdrl2，以及水稻dl突变体均表现出心皮发育异常。同样，拟南芥中DL的直系同源基因CRABS CLAW (CRC)调控蜜腺和心皮的发育，尽管CRC可能具有祖先的叶片发育功能。不仅DL同时作用于芒和心皮，大麦中的SHORT INTERNODES/STYLISH (SHI)同源基因也在芒和心皮发育中发挥作用。在水稻中，一种表皮图案因子样蛋白（EPFL）调控芒长和籽粒长度，这可能与心皮大小有关。确实，越来越多的基因被发现同时参与心皮和外稃的发育。在某些情况下，由于外稃尺寸减少导致发育中的籽粒受到物理限制，心皮发育受限。而在不受物理限制的情况下，我们认为基因在外稃和心皮发育中的双重作用是其共同进化起源的结果。尽管所有花器官都是叶片的同源器官，但DL突变体对颖片和内外稃的影响并不显著。DL同源基因的突变对中部和远端叶同源器官部分的影响最强。或许颖片和内外稃缺乏这些结构部分，类似于无芒外稃，因此受到的影响较弱。

DL的表达可能并不是芒进化中的简单“开关”，原因如下：首先，在水稻、短柄草和玉米中，DL同源基因对近端-远端模式的调控作用较为微弱。其次，在芒和无芒水稻中，DL表达没有显著差异，这表明在水稻中驱动芒发育差异的可能是DL下游的过程，而非DL本身。然而，在更深的系统发育层次上， DL表达存在差异。在无芒的玉米中， DL同源基因仅在外稃原基发育早期表达。而在可产生芒的水稻、高粱和小麦中，DL在外稃中脉的表达持续至发育后期。这一点与玉米、高粱、水稻和小麦的营养叶片中DL的表达模式相似：DL在早期叶原基中广泛表达，而后期则限制在中脉区域。因此，DL表达时机的差异可能导致属间的差异。然而，叶片发育网络本身十分复杂，芒的进化历史亦然。不同物种间芒的出现和消失机制可能各不相同。

发育限制通常被视为一种约束，只能防止表型的出现。而我们强调发育限制在促进性状反复进化中的积极作用。我们的研究结果突出了植物遗传过程的基本关联性，表明在植物性状的反复进化实例中，发育限制的积极作用可能很普遍，尤其是在许多地上器官是叶片同源结构的情况下。

Cite

Patterson, E., MacGregor, D.R., Heeney, M.M., Gallagher, J., O'Connor, D., Nuesslein, B. and Bartlett, M.E. (2024),

Developmental constraint underlies the replicated evolution of grass awns. New Phytol.

https://doi.org/10.1111/nph.20268