摘要
榕树和榕小蜂是植物与授粉者共演化的最亲密的例子之一。随着在地理上相互隔离的榕树种群的多样化，榕树和榕小蜂都经历了由局部适应和协同演化驱动的选择压力。薜荔（Ficus pumila）包括两个生态上不同的变种：薜荔本种（F. pumila var. pumila），广泛分布于东亚的低地地带；而爱玉子（F. pumila var. awkeotsang）则是台湾特有种，生长于中海拔地区。为了阐明与薜荔宿主的共同演化如何影响榕小蜂的进化轨迹，我们分析了Wiebesia sp. 2和sp. 3的基因组，分别是薜荔和爱玉子的授粉者。我们的种群动态分析表明，最后一个冰期的分隔促进了这两对薜荔与榕小蜂之间的生态差异化。通过比较和种群基因组分析，我们识别出与栖息地适应相关的选择信号，进化速率与宿主薜荔的生活史特征相对应。宿主偏好行为、化学感知基因表达的变化，以及嗅觉受体的适应性重复，突显了适应宿主花香的潜在机制。这些发现共同强调了薜荔与其授粉榕小蜂之间的强制互惠关系如何使薜荔宿主的生态特征和栖息地偏好塑造其授粉者的进化路径，并在榕小蜂基因组中留下独特的分子印记。本研究展示了植物与授粉者之间紧密且相互交织的生活史驱动适应与多样化的能力。
图1 榕树-榕小蜂研究体系
背景介绍
开花植物与其昆虫授粉者之间的相互作用对这两类群体的巨大生物多样性贡献良多。尽管这些相互作用广泛存在，我们对在微进化尺度上协同演化涉及的遗传过程的理解仍然有限——这是产生生物多样性的初始步骤。研究协同演化的一大挑战在于生物体与其环境相互作用的复杂性，使得从多个生物和非生物来源中分解出选择压力变得困难。
授粉者榕小蜂（Hymenoptera: Agaondiae）与榕树（Moraceae: Ficus）之间的互惠关系为探索协同演化提供了一个特殊的系统。榕树进化出了奇特的果实状花序，称为隐头花序（单数：syconium），其中容纳着花朵。这些花朵仅由榕小蜂授粉，而榕小蜂则依赖于隐头花序中的特化腺（短花柱和无生殖能力）来产卵。榕小蜂几乎在整个生命周期内都生活在花序内。雌性榕小蜂只有在交配后才会离开花序，并且只有几天的时间寻找另一个花序。因此，榕树与榕小蜂共享一个共同的非生物环境，而榕小蜂所接触的生物环境则主要限于榕树花序内的群落。
雌性榕小蜂被其相关宿主的独特花香挥发化合物所吸引。宿主花香的多样性影响了相关榕小蜂的偏好行为，并可以促进合子前障碍的形成。因此，气味的识别是这种互惠关系特异性的关键。榕树与授粉榕小蜂之间紧密相连的生命周期表明，生态特征（如生活史、栖息地偏好和榕树宿主的花香）对其相关授粉者的基本进化过程具有深远的影响，并在授粉者的基因组中留下了分子标记。
最近在非模式生物的基因组研究中的进展揭示了榕树与榕小蜂之间的协同演化动态。然而，关于差异化种群如何受到不同共演化压力影响的研究仍然较少。因此，基因组调查显得尤为重要。
薜荔（Ficus pumila L.）的不同变种及其相关的授粉榕小蜂为此类研究提供了理想的候选对象。薜荔是一种雌雄异株的物种，由两个生态上不同的变种组成。薜荔（F. pumila L. var. pumila），被称为蔓生榕，广泛分布于东亚的低地地带；而爱玉子（F. pumila var. awkeotsang (Makino) Corner）则生长在台湾的中海拔地区（图1a，1b）。这两个变种在生活史特征上存在差异，包括隐头花序的大小和物候（图1a）。雄性薜荔每年经历三到四次开花周期，而雄性爱玉子通常只有一到两个开花周期。这两个变种在其花香挥发化合物的组成上也存在差异。
关于薜荔授粉者的生态研究相对较少。最初被分类为单一物种的榕小蜂（Wiebesia pumilae），根据基因证据，现已分为三个物种。Wiebesia sp. 1及其南方近缘种W. sp. 2授粉蔓生榕，而Wiebesia sp. 3则授粉爱玉子。一项针对来自东亚大陆的蔓生榕和W. sp. 2的开创性基因组研究提供了关于该授粉系统中化学感知协同演化的重要见解。然而，这些榕小蜂与薜荔变种之间的协同演化的生物地理历史和基因组机制尚不清楚。
在本研究中，我们提供了来自台湾的W. sp. 2和W. sp. 3的基因组序列，分别是蔓生榕和爱玉子的授粉者。这些基因组为共演化的基因组过程提供了全面的见解。我们首先重建了种群历史，以解释这两种物种的生态位分化。随后，我们探索适应不同生态位的基因组特征。通过行为实验和转录组学分析，我们研究这近缘的榕小蜂的宿主偏好的演变。最后，通过整合其他榕小蜂的嗅觉受体注释，我们调查了榕树与榕小蜂协同演化中的宿主特异性及其潜在的遗传基础。
结果
基因组测序、组装与注释
我们使用PacBio长读长对Wiebesia sp. 3的基因组进行了de novo组装（表S1），并应用Blobtools去除可能的污染物。随后，通过结合长读长和短读长数据对初始基因组进行精修，最终得到一个323.8 Mbp的基因组（表1）。该基因组由230个contig组成（N50=18.6 Mbp），GC含量为30.16%，且未发现残余污染的迹象（图S1）。W. sp. 3基因组的完整BUSCO评分为93.7%。根据kmer估计，97%的基因组序列被组装。组装统计数据和BUSCO评分表明，该基因组具有高度连续性，并可与其他榕小蜂基因组相媲美（表S2，图S2）。此外，我们从台湾的W. sp. 2种群获得了80×的短读长，并进行了基于参考的组装。
我们采用相同的实验方案，独立注释了这两个基因组。基因组中约识别出10%的重复序列（表S3）。通过EVidenceModeler pipeline，分别注释了W. sp. 3和W. sp. 2的13,342和13,684个编码蛋白质基因（表S4）。经过Web Apollo的人工审校，基因集中保留了10,072和10,037个基因（表1）。尽管基因数量有所减少，经过人工审校后，两个物种基因集的BUSCO值分别从93.0%提高到95.5%（W. sp. 3）和从92.8%提高到95.7%（W. sp. 2）。因此，这些注释在所有可用的榕小蜂基因组中属于最完整的（表S2）。Blast2GO对功能基因的注释报告显示，95%的基因在公共数据集中至少有一个匹配的结果（图S3）。
物种分化与末次冰期的关系
基因组DNA文库是由各自物种的30个 pooled 个体构建的。为了理解这两个物种的分化历史，我们应用PoolParty pipeline来估计全基因组的种群基因组参数。随后，使用fastsimcoal2模拟和评估不同的种群模型（表S5）。在所有测试的模型中，得到的支持度最高的假设是考虑到W. sp. 3和W. sp. 2之间的早期和近期基因流（图2；表S5）。在这一假设中，W. sp. 3和W. sp. 2在中更新世分化，大约是在55万年前，随后发生了基因流，主要是从W. sp. 3流向W. sp. 2。基因流在约8万年前至1万年前期间完全停止。值得注意的是，这一完全隔离期与末次冰期（约11.5万年至1.17万年前；Dansgaard et al. 1993）重叠。之后，基因流重新建立，W. sp. 2向W. sp. 3的迁移更为显著。
进化速率差异与代谢相关适应
我们比较了W. sp. 2和W. sp. 3之间的进化速率。W. sp. 3谱系的非同义突变率（dN）和同义突变率（dS）分别为0.88 × 10⁻³和5.89 × 10⁻³。这些估计值显著低于W. sp. 2的（dN：1.15 × 10⁻³和dS：7.05 × 10⁻³；p < 10⁻¹⁰）（表2）。我们还比较了不同W. sp. 2种群在台湾海峡的进化速率，使用了来自中国大陆的已发表的W. sp. 2基因组。有趣的是，在W. sp. 2中，中国种群的替代率比来自台湾的W. sp. 2高出6%（dN）和4%（dS）（表2）。
图2 两种榕小蜂的种群动态历史
在榕小蜂物种之间的9,352个单拷贝直系同源基因中，有643个显示出选择信号（dN/dS比率 > 1），这些基因在与丝氨酸酶和呼吸链复合体IV相关的GO中富集（表3）。Tajima’s D检验显示，W. sp. 3基因组中总共有433个蛋白质编码基因呈现负值，暗示种群增长或正选择。GO分析显示，这些基因富集于代谢过程、蛋白酶体复合体和分子结合（表S6）。在W. sp. 2中，348个基因显示出负的Tajima’s D值，但未识别出特定的富集GO术语。总之，通过直接和基于选择的关联方法，我们证明了可能受到正选择的基因在能量产生和代谢中富集。
两种榕小蜂物种在宿主特异性方面存在不均等的分化
为了理解宿主吸引表型及其如何影响这一协同进化系统中的宿主特异性，我们对两种榕小蜂物种进行了行为实验。我们分别将这两种物种引入其替代宿主变种的雌性和雄性可接受的榕树果序，并以其自然宿主变种作为对照。W. sp. 3偶尔进入薜荔的雄性果序（表4），但其进入率明显较低且不稳定（0.2±0.2），相比之下，自然授粉者W. sp. 2的进入率更高且更稳定（0.3±0.06，p值 < 10⁻¹⁶）。相反，在所有24次重复实验中，W. sp. 2从未进入爱玉子的雄性果序。我们的行为实验结果表明，这两种近缘的榕小蜂在宿主特异性上存在部分特异性，并在宿主偏好行为上存在不均等的分化。
嗅觉表达谱的分化
为了检验基因调控的变化是否导致两种榕小蜂宿主偏好的分化，我们对W. sp. 2和W. sp. 3的成虫雌性转录组数据进行了测序和比较（图S4，S5）。在8,701个表达基因中，有432个基因在两种物种之间表现出差异表达。GO富集分析显示，这些差异表达的基因与嗅觉、细胞信号转导、丝氨酸型内肽酶活性和外骨骼结构相关（表5）。在两种榕小蜂物种中，差异表达的化学感受基因在W. sp. 2和W. sp. 3以及模式榕小蜂物种-大果榕小蜂（Ceratosolen solmsi）中似乎都是单拷贝的。值得注意的是，在W. sp. 2中检测到的负责检测驱虫气味信号的OBP11在W. sp. 3中显著下调（表S7）。此外，在化学感受基因中，嗅觉受体不仅在物种间表现出差异表达，还显示出整体dN/dS比率升高，与基因组背景相比，具有dN/dS比率 > 1的基因比例显著更高（表S8）。
嗅觉受体家族的谱系特异性扩张与收缩
为了更好地理解与宿主气味的协同分化如何在更广泛的进化尺度上塑造授粉榕小蜂的嗅觉受体（OR）基因演化，我们扩大了样本范围，包括来自另一个雌雄异株谱系的榕小蜂C. solmsi，以及两种雌雄同株的榕小蜂物种：Elisabethiella stuenckenbergi和Eupristina verticillata。因此，我们的比较涵盖了不同宿主性别系统的谱系，便于深入洞察OR家族大小的演变（图3）。虽然在所有研究的榕小蜂中，OR基因家族的数量大体保持稳定，但在每个主要的授粉榕小蜂谱系中发现了OR基因家族的独立增减（图3）。
图3 榕小蜂OR受体基因家族的扩张收缩分析
对OR基因树（图S6，图4）的深入分析揭示了谱系特异性基因增减的细节。值得注意的是，Z亚家族在所有四个研究的榕小蜂属中均独立扩张（图4a）。在基因树中还可以找到其他分散的谱系特异性扩张（例如图4c，另见图S6）。进一步的共线性比较表明，这些扩张是由于多个局部串联重复阵列造成的（图4b和d）。总体而言，这些数据表明，授粉榕小蜂中的OR基因经历了动态的演化，串联重复为新OR基因的出现提供了重要贡献。
图4 串联重复介导OR受体基因家族扩张的例子
重复的嗅觉受体的加速演化
为了测试重复的嗅觉受体（OR）是否经历了不同的选择压力，我们应用了基于密码子的分支位点选择分析。首先，我们通过预测这些基因中存在的跨膜域数量来评估注释的OR的质量。只有那些平均跨膜域数超过五的物种被用于确保信息的充分性（表S9）。这些物种包括C. solmsi和两种Wiebesia物种。这三种物种的OR被分为两组：简单直系同源群和复杂直系同源群（图S7）。前者由这三种物种的单拷贝直系同源基因组成，而后者则包含包括重复旁系同源基因的单系基因树。值得注意的是，在复杂直系同源群中的41个分支中，有五个展示了正选择的特征，这一比例显著高于简单直系同源群中的87个分支中的两个（p < 0.05）。这表明，复杂直系同源群中正选择的发生率高于简单直系同源群，暗示重复的OR更可能经历正选择。
讨论
在本研究中，我们探讨了两种密切相关的榕小蜂物种的共同演化的基因组格局。通过结合基因组学、转录组学和行为数据，我们揭示了这些授粉榕小蜂的生态特化和嗅觉共同演化背后的遗传特征。我们的研究结果强调了宿主生活史和生态条件对其授粉者进化轨迹的强烈影响，展示了紧密相连的生命周期如何塑造适应性和多样性。
榕小蜂种群的分化与生态差异
我们的种群模型表明，W. sp. 2和W. sp. 3的共同祖先在大约547,000年前的中更新世开始分化，这可能代表了祖先薜荔-榕小蜂从东亚大陆迁徙至台湾的过程（图2b1）。这两种物种的估计种群规模也反映了它们分布范围的差异，广泛分布的W. sp. 2的有效种群数量约为地方性W. sp. 3的两倍（图2a）。这两种物种之间的迁移在80,000年前停止，导致完全隔离，这恰好与末次冰期的开始（115,000–11,700年前）（图2b2）重合。在此期间，爱玉子-W. sp. 3可能一直局限于台湾，而它们的大陆亲属则撤退到温暖的南方庇护地带。这与古花粉记录显示的在末次冰期内蔓生榕偏好的生境撤退一致。约在10,000年前迁移重新开始并持续至今（图2a）。这与蔓生榕在东亚的末次冰期扩张重合，包括蔓生榕/W. sp. 2重新殖民台湾低地地带（图2b3）。基于遗传标记的先前研究将更新世气候波动与榕小蜂种群的分布和物种形成联系起来，我们的发现进一步支持并阐明了这些分化过程。
我们的结果也解释了为什么爱玉子-W. sp. 3目前栖息在台湾500到2000米的海拔高度；即它们的祖先适应了在末次冰期时6-7°C较凉爽的环境。先前的研究表明，W. sp. 3在较低温度下存活的时间更长，并且在其线粒体标记中展示了正选择信号，这与W. sp. 2形成对比。在本研究中，我们检测到与能量生产和代谢相关的W. sp. 3的全基因组正选择特征，从而为寒冷适应提供了遗传机制。综合来看，种群和选择分析都支持这样一种进化假设：爱玉子-W. sp. 3在末次冰期与大陆蔓生榕-W. sp. 2的隔离导致了对较冷环境的局部适应，最终在全新世气候下表现为生态位分化。
除了不同的栖息地偏好，这两种宿主品种还表现出不同的生活史特征。根据地理位置，雄性蔓生榕每年产生三到四轮果实，而雄性爱玉子仅产生一到两轮。每轮雄性果实的生成通常是同步的，以便它们可以饲养来自前一轮的榕小蜂后代。因此，榕小蜂的生命周期完全依赖于并与宿主的表型同步。这两种榕小蜂物种之间的世代时间不同。
我们观察到W. sp. 2的替换率显著高于W. sp. 3（表3），这与世代时间的差异相符。除了世代时间的影响，低地栖息地的较高温度也可能增加冷血昆虫的突变率。来自中国的W. sp. 2的替换率甚至更高（表3）。在台湾海峡的W. sp. 2种群之间替换率的差异可能是由于W. sp. 2和W. sp. 3之间的基因流动所致，正如种群分析所示。
两种榕小蜂物种宿主特异性的遗传基础
嗅觉共同适应被认为是榕树-榕小蜂共生关系中，维持宿主与授粉者特异性的重要特征。先前的研究表明，两种薜荔变种的花香挥发物谱存在差异。因此，预计榕小蜂物种之间的化学感知基因会出现差异是合理的。我们的基因表达和进化分析显示，化学感知基因在榕小蜂物种之间存在差异表达（表6），并展现出适应性进化的迹象（表S7），这表明它们在塑造宿主特异性方面发挥了作用。行为实验表明，W. sp. 2和W. sp. 3具有宿主特异性，尽管W. sp. 3也能对蔓生榕的雄性果实作出反应，这一现象在野外采样中也有所记录。这些发现突显了嗅觉适应在授粉者响应宿主特定化学信号方面驱动进化分化的作用。
在化学感知基因中，OBP11是一个有趣的候选基因，可能解释两种小蜂之间的表型差异。我们发现W. sp. 2中的OBP11表达显著高于W. sp. 3。Wiebesia sp. 2使用OBP11来检测来自蔓生榕的排斥分子九烯（nonanal）。果冻无花果（W. sp. 3的宿主）在接收阶段雄性果实中释放的九烯量相对高于蔓生榕。因此，我们推测W. sp. 2中OBP11的高表达使其对九烯的排斥信号的敏感性高于W. sp. 3。这可能解释了为什么W. sp. 2对爱玉子的吸引力较低；而W. sp. 3虽然表现出偏好，但在对两种宿主的吸引力上更具灵活性。
化学感知受体基因动态及其对长期榕树-榕小蜂共演化的影响
榕小蜂中化学感知受体基因数量的大幅减少被认为是与榕树之间互利关系的结果。另一方面，近期的一项转录组研究表明，尽管榕小蜂的嗅觉受体（OR）基因总数是保守且显著减少的，不同谱系表现出不同的基因增益和损失模式。我们的基于基因组的分析证实了这一发现。此外，我们还展示了许多新型OR基因源于局部串联重复，这些重复的OR基因相比于复制数保守的同源基因表现出更高的正选择信号频率，表明这些重复基因功能发生了分化。化学感知受体基因的扩张与昆虫的各种嗅觉相关适应性有关。在膜翅目中，一个著名的例子是几个群体性谱系中OR 9外显子亚家族的独立扩张。因此，OR基因的适应性复制，例如在Z亚家族中观察到的，可能在榕树花香与小蜂嗅觉识别的共演化中发挥了关键作用。
结论
通过对授粉小蜂的多组学和行为分析，我们在W. sp. 3中检测到了与能量生产和代谢相关的全基因组正选择信号，这表明其可能适应于较冷的中等海拔环境。我们还观察到W. sp. 3的替代率显著低于W. sp. 2，这与其高海拔、成长缓慢的宿主——爱玉子——相关的较长世代时间一致。此外，化学感知基因表达的差异和嗅觉受体的适应性复制暗示了与宿主花香的共同适应机制。综合来看，这些发现表明，由于榕树宿主和其授粉小蜂的生命周期紧密相连，榕树宿主的生活史特征和栖息地偏好可以直接影响其相关授粉者的进化过程，从而在它们的基因组中留下独特的分子特征。这些结果有助于更广泛地理解共演化动态，揭示了共分化的基因组过程。
未来的研究应重点探索完整的共系统发育，包括这两种宿主变种，以及其他共同授粉者如W. sp. 1。虽然我们已进行了多组学和行为分析，但结合来自小蜂和榕树的数据的功能基因组研究和实验验证是弥合分子表型与宏观表型之间差距的必要步骤。
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bioRxiv 2024.10.22.619299;
doi: https://doi.org/10.1101/2024.10.22.619299
