导读：这篇文章以C3水稻和C4高粱为研究对象，利用单细胞（核）转录组技术，绘制了两种植物光形态建成期间不同发育时间阶段，不同发育组织（叶肉和维管束鞘细胞）的转录组和染色质可及性图谱。作者发现，C4高粱维管束鞘中的C4基因表达，与一个能与DOF家族转录因子结合的顺式作用元件有关，该元件能够激活C4基因在维管束鞘细胞中的强烈表达，从而赋予C4高粱维管束鞘细胞新的功能。不过这种演化机制是利用已有的调控网络和模块，实质是对相关序列的co-option或rewiring，这可能一定程度上解释了为什么C4植物谱系独立演化了多次。最后，作者们畅想，利用该知识，对C3作物，例如水稻，进行工程化改造，使其能应对日益严峻的全球变暖和干燥，同时获得更强的光合作用效率，这无疑将为保障粮食和食品安全做出重大贡献。幸运的是，似乎我们离这个目标又近了一步。
注：此篇文章于今年1月26日向Nature投稿，10月11日接受，11月20日在线。文章只经过了一轮审稿就通过了，而且4位审稿人均给出了高度评价，认为文章的实验设计和分析十分巧妙，审稿人更多是对文本和图片等内容提出建议，并没有提出较重的关切，普遍认为简单修改后即可接受。此外，审稿人还高度赞扬了作者在代码公开方面做的非常好，脚本按照顺序进行了编排，并在Readme文档给出了脚本使用的介绍。
以下内容包括：Nature 新闻稿、文章全文翻译、审稿意见。
Nature新闻报道
By Monalisha Rath & Dominique Bergmann演化创新为作物高效光合作用的工程改造提供启示
通过比较相关植物，研究人员识别出基因表达转换的原因，这一转换促使了一种更高效的光合作用形式的演化，为工程化设计更高产的作物铺平了道路。
图1 | 基因表达的转换促进了高效光合作用的演化
a，在进行“C3”光合作用的植物叶片中，Rubisco酶将CO₂转化为三碳分子（C3），后者通过一系列反应（Calvin–Benson循环）被合成为糖。这一途径效率较低，因为在这些细胞中丰富的O₂也会与Rubisco反应。C3光合作用仅发生在叶肉细胞中，在这些细胞内，编码光合作用所需蛋白的基因在特定转录因子控制下，由叶肉细胞特异性的DNA调控区域（顺式调控元件）调节表达（未显示）。相邻的维管束鞘细胞不表达光合作用基因，但表达称为DOF的转录因子。
b，一种更高效的光合作用形式C4光合作用，由C3光合作用演化而来。在C4植物中，四碳分子（C4）在叶肉细胞中生成，并被运输到维管束鞘细胞，在那里Calvin–Benson循环可以远离氧气的干扰。Swift等人的研究显示，在演化过程中，光合作用基因获得了能够与维管束鞘细胞特异性DOF转录因子结合的顺式调控元件，从而使这些基因在维管束鞘细胞中表达。
光合作用利用太阳能和大气中的二氧化碳生成碳水化合物，可以说是地球上最重要的生化反应之一。包括人类在内的几乎所有生命都依赖光合作用的产物。然而，在炎热干旱的气候条件下，光合作用的核心酶可能会参与非生产性反应（non-productive reactions），这给作物种植带来了挑战，尤其是在全球气温不断升高的背景下。今天发表在《自然》杂志上的一项研究，Swift及其团队通过绘制水稻（Oryza sativa）和高粱（Sorghum bicolor）叶片中光合作用基因的表达图谱，展示了基因何时何地被激活或抑制。高粱通过一种替代模式的光合作用克服了低效的问题，研究人员通过比较这些图谱，解码了实现这种高效光合作用的背后机制。这一成果可能为水稻中实现这种高效光合作用提供方向。
在最常见的光合作用形式中，大气中的二氧化碳（CO₂）在叶片的叶肉细胞中与Rubisco酶发生作用。在那里，CO₂被转化为三碳化合物（C3），并通过随后的Calvin–Benson循环反应被加工成糖。然而，Rubisco也可能与氧气反应，生成一种有毒的中间产物，同时伴随着糖前体物质的形成。在炎热和干燥的条件下，这种不良反应会更加严重。
高产作物如玉米（Zea mays，也称为玉蜀黍）和高粱，通过采用一种称为C4光合作用的替代形式，降低了氧气与CO₂竞争的可能性。在C4植物中，反应在空间上被分隔开。叶肉细胞中产生一种酶，将CO₂固定为四碳化合物，这种中间产物被输送到相邻的维管束鞘细胞中。维管束鞘细胞围绕叶片的输水组织分布，其中Rubisco酶含量丰富，但氧气含量较低。当四碳化合物在这些细胞中分解时，释放出的CO₂能够更高效地被Rubisco固定，与C3植物相比具有显著优势。
为了满足全球粮食需求并提高温暖和干旱气候下的作物生产力，科学家提出了一个雄心勃勃的设想：通过工程化改造，将C4植物的解剖和生化特性引入C3水稻。研究发现，C4光合作用所需的酶和转运蛋白编码基因在C3植物中已经存在，并且C4植物在演化过程中从C3植物谱系中独立演化了超过60次，这些成果为实现这一设想提供了可行性的理论支持。原则上，如果能在C3植物中适当的位置表达所需水平的光合作用酶和转运蛋白，就可以实现C4代谢的引入。关键在于找到实现这一目标的“密码”。
Swift及其团队通过对光合作用相关基因表达的全局视角开展分析，将科学家向着解码这一“密码”的又迈出了一步。他们开发了单核RNA测序技术，能够对叶片中所有细胞类型的所有基因表达进行全面分析，并在叶片暴露于光照后的不同时间重复这些实验，从而将基因表达的变化与光合作用能力的提升联系起来。一个关键的实验设计是选择了C4高粱和C3水稻两种禾本科植物作为研究对象，这两者在许多方面非常相似，使基因表达变化易于观察。例如，表皮细胞（构成植物外表面）在两种植物中的基因表达谱非常相似，但维管束鞘细胞中的表达谱差异显著。通过解析数十万个特定细胞类型的基因表达谱，研究人员寻找在水稻叶肉细胞中表达，但也在高粱维管束鞘细胞中表达的光合作用基因。这些基因在演化过程中从C3到C4光合作用演化过程中发生了表达位置的“转换”。
是什么促成了基因表达模式的改变？Swift等人研究了称为顺式调控元件（cis-regulatory elements）的DNA区域，这些区域包含被特定转录因子识别的序列。他们特别关注了靠近基因的顺式调控元件，这些基因仅在叶肉细胞或维管束鞘细胞中对转录复合体开放。当水稻叶肉细胞中表达的光合作用基因在高粱中切换到维管束鞘细胞中表达时，这些基因获得了能够结合一类名为DOF的转录因子家族的顺式调控元件。这些植物特有的转录因子参与多种生物过程，包括细胞身份的特化，且在水稻和高粱的维管束鞘细胞中优先表达。初步功能测试表明，DOF可以诱导光合作用基因的表达，并且对这些基因在维管束鞘细胞中的高水平表达是必需的。今年的发表的相关研究进一步支持并扩展了这一发现，研究了其他C4物种中光合作用基因的顺式调控区域。
Swift及其团队得出结论，决定细胞类型的基因网络在C3和C4物种中是稳定的，而光合作用基因在维管束鞘细胞中的表达则是因为这些基因获得了与维管束鞘细胞特有转录因子结合的顺式调控元件。这种策略看似反直觉，因为C4光合作用只有在所有组成部分都存在于正确的细胞类型中时才能高效运行，而每个光合作用基因都必须独立获得顺式调控元件。然而，通过顺式调控元件的变化，重新构建基因网络在植物演化中似乎十分常见。
科学家在将替代顺式调控元件引入水稻光合作用基因方面还有多远？目前的进展令人鼓舞。结合多种工程工具的植物基因组编辑技术非常适合这类策略，即在基因附近插入转录因子结合位点大小的序列。剩下的挑战是将编码细胞类型特异性的调控元件与能够在相关条件下提升基因表达的元件结合起来。
尚未深入研究的问题是，仅仅在维管束鞘细胞中引入C4光合作用基因表达是否足够，或者光合作用基因（如编码Rubisco的基因）是否需要在叶肉细胞中被抑制。此外，是否需要对转运蛋白进行工程改造，以加速代谢分子在叶肉细胞和维管束鞘细胞之间的主动运输，目前也尚不清楚。要实现C4光合作用，仍需对水稻的生化和解剖特性进行大量优化。然而，创造性地利用创新技术以及比较许多独立的C3到C4转变案例，不断为这一领域带来了巨大希望。
doi: https://doi.org/10.1038/d41586-024-03553-5
References
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3.Mendieta, J. P. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 121, e2402781121 (2024).
4.Borowsky, A. T. & Bailey-Serres, J. Nature Genet. 56, 1574–1582 (2024).
5.Liu, P. et al. Nature 631, 593–600 (2024).
全文翻译
摘要
C4光合作用是地球上生产力最高的植物普遍采用的光合作用方式，与祖先型的C3途径相比，其效率提高了50%。在超过60个C4演化支系中，CO₂固定反应被不同的组织隔离开来，维管束鞘细胞（bundle-sheath cells）也具有了光合作用活性。然而，维管束鞘细胞如何获得这种替代身份以实现高效光合作用目前仍不清楚。在此研究中，我们发现C4叶片中，维管束鞘基因表达的变化与C3叶片中已存在的顺式编码（cis-code）的获取相关。从单核基因表达（single-nucleus gene-expression）和染色质可及性图谱（chromatin-accessibility atlases）中，我们识别出DNA单指结合（DNA binding with one finger，DOF）基序，它定义了主粮作物C3水稻和C4高粱中的维管束鞘细胞特性。在C4高粱中被重新编排，维管束鞘细胞中强烈表达的光合作用基因获得了能够被DOF识别的顺式调控元件。我们的研究结果与一个简单模型相一致，该模型认为C4光合作用是通过招募与维管束鞘细胞特性相关的祖先顺式编码实现的。这些顺式元件的获得利用了在C3和C4叶片中细胞类型之间稳定的转录因子模式，从而在维管束鞘细胞中激活了光合作用。我们的发现为复杂C4途径的演化提供了分子层面的见解，同时也为通过合理设计，在C3作物中实现C4光合作用以提高作物生产力和抗逆性提供了指导。
背景介绍
在多细胞生物中，基因表达模式的变化驱动了细胞功能的改变和性状的演化。一个显著的例子是，在超过60个植物演化支系中，光合作用在不同细胞类型间的分隔，使得高效的C4光合作用途径得以从祖先型的C3状态演化而来。在大多数陆地植物中，CO₂的固定发生在叶肉细胞中，并依赖于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）。由于RuBisCO的第一固定产物为三碳代谢物，这种途径被称为C3光合作用。尽管大多数陆地植物使用C3途径，RuBisCO无法完全区分CO₂和O₂。除了导致碳固定效率下降外，RuBisCO的加氧反应还会产生一种有毒中间产物磷酸乙醇酸，这种物质必须通过耗能的光呼吸循环迅速代谢。在包括玉米和高粱等主要作物的多个植物演化支系中，叶肉细胞和维管束鞘细胞的功能被重新分配，使得RuBisCO在叶肉细胞中的CO₂固定受到抑制，而在维管束鞘细胞中被激活（图1a）。这些植物被称为C4植物，因为其光合作用途径的第一步在叶肉细胞中生成C4酸，这些酸随后扩散到维管束鞘细胞，在RuBisCO附近发生脱羧反应。这一过程使维管束鞘叶绿体中的CO₂浓度提高了十倍，从而缓和了加氧反应，大幅提升了光合作用效率、水分利用效率和氮利用效率。因此，C4植物在炎热干旱的气候中表现尤为优异，是全球生产力最高的一些作物种类之一。
图1：去黄化（de-etiolation）过程中水稻和高粱单细胞核（single nuclei）的基因表达与染色质可及性图谱
a，C3和C4植物中叶肉细胞与维管束鞘细胞的光合作用。CA：碳酸酐酶；ME：苹果酸酶；PEPC：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
b，去黄化时间进程示意图。植物在黑暗中生长5天（0小时时间点）后暴露于光照环境。
c，水稻和高粱叶肉细胞与维管束鞘细胞中白色体与叶绿体的扫描电子显微镜图（SEM）。类囊体堆叠结构（黑色箭头）出现在水稻叶肉细胞和维管束鞘细胞的叶绿体中，以及高粱叶肉细胞的叶绿体中（SEM结果在三次生物重复中一致）。比例尺，1 μm。
d, e，水稻（d）和高粱（e）各时间点细胞核转录谱的UMAP图。不同颜色表示不同细胞类型。
f, g，染色质可及性分析。在水稻启动子区域中，共检测到2,948个细胞类型特异性可及峰（f）；在高粱启动子区域中，检测到1,820个细胞类型特异性可及峰（g）。
在C3和C4植物中，光合作用效率依赖于叶片各类型细胞间基因表达差异的模式化机制。然而，到目前为止，仅有少数与C4基因细胞特异性表达相关的顺式元件被识别出来。对于光合作用在细胞类型之间的严格分区是如何建立和维持的，或者这些模式如何改变以促使C4光合作用从祖先C3途径哪里演化而来，目前尚不清楚。
为了定义每种细胞类型的转录特性，并揭示光合作用基因表达模式的建立机制，我们在使用C3途径的水稻和使用C4途径的高粱中生成了基因表达和染色质可及性图谱。我们在将幼苗从黑暗转移至光照后的不同时间点取样——这一刺激诱导光形态建成并激活光合作用基因的表达。水稻和高粱均是全球重要的模式作物和二倍体作物，代表了单子叶植物中两个不同的演化分支，这两个分支大约在8100万年前分化。核型重建表明，高粱和水稻以及它们的草类祖先有着共享的基因组结构。因此，水稻和高粱间共享的每种细胞类型的分子特性可能也存在于其共同祖先衍生的约11,000种禾本科植物中。
在这两种作物中，我们发现光照能够迅速诱导所有细胞类型的基因表达。然而，在感知光照之前，许多光合作用基因的表达和染色质可及性已经由细胞特性决定。尽管转录水平的细胞特效在物种间存在变化，但定义细胞特性的顺式元件是保守的。在C4高粱中，重新调整表达模式并变为维管束鞘细胞特异性的基因，获得了能够指导C3植物维管束鞘表达的祖先顺式元件。最简单的解释是，光合作用的演化涉及C4基因获得与维管束鞘细胞特性相关的顺式元件，从而利用了C3和C4叶片各细胞类型间稳定的转录因子模式机制。
结果
1、在多细胞生物中，基因表达模式的变化驱动了细胞功能的改变和性状的演化。
一个显著的例子是，超过60条植物演化支系中，光合作用在不同细胞类型间的分隔，使得高效的C4光合作用途径从祖先级的C3状态演化而来。在大多数陆地植物中，CO₂的固定发生在叶肉细胞中，并依赖于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）。由于RuBisCO的第一固定产物为三碳代谢物，这种途径被称为C3光合作用。尽管大多数陆地植物使用C3途径，RuBisCO无法完全区分CO₂和O₂。除了导致碳固定效率下降外，RuBisCO的加氧反应还会产生一种有毒中间产物磷酸乙醇酸，这种物质必须通过耗能的光呼吸循环迅速代谢。
在包括玉米和高粱等主要作物的多条植物演化支系中，叶肉细胞和维管束鞘细胞的功能被重新分配，使得RuBisCO在叶肉细胞中的CO₂固定受到抑制，而在维管束鞘细胞中被激活（图1a）。这些植物被称为C4植物，因为其光合作用途径的第一步在叶肉细胞中生成C4酸，这些酸随后扩散到维管束鞘细胞，在RuBisCO附近发生脱羧反应。这一过程使维管束鞘叶绿体中的CO₂浓度提高了十倍，从而减少了加氧反应，大幅提升了光合作用效率、水分利用效率和氮利用效率。因此，C4植物在炎热干旱的气候中表现尤为优异，是全球生产力最高的一些作物种类之一。
在C3和C4植物中，光合作用效率依赖于叶片各细胞类型间基因表达差异的模式化机制。然而，到目前为止，仅有少数与C4基因细胞特异性表达相关的顺式元件被识别出来。对于光合作用在细胞类型之间的严格分区是如何建立和维持的，或者这些模式如何改变以促使C4光合作用从祖先C3途径演化而来，尚不清楚。
为了定义每种细胞类型的转录特性，并揭示光合作用基因表达模式的建立机制，我们在使用C3途径的水稻和使用C4途径的高粱中生成了基因表达和染色质可及性图谱。我们在将幼苗从黑暗转移至光照后的不同时间点取样——这一刺激诱导光形态建成并激活光合作用基因的表达。水稻和高粱均是全球重要的模式作物和二倍体作物，代表了单子叶植物中两个不同的演化分支，这两个分支大约在8100万年前分化。核型重建表明，高粱和水稻以及它们的草类祖先共享基因组结构。因此，水稻和高粱共享的每种细胞类型的分子特性可能也存在于其共同祖先衍生的约11,000种植物中。
在这两种作物中，我们发现光照能够迅速诱导所有细胞类型的基因表达。然而，在感知光照之前，许多光合作用基因的表达和染色质可及性已经由细胞身份决定。尽管转录性细胞身份在物种间存在变化，但定义细胞身份的顺式元件是保守的。在C4高粱中，重新调整表达模式并变为维管束鞘细胞特异性的基因，获得了能够指导C3植物维管束鞘表达的祖先顺式元件。最简单的解释是，光合作用的演化涉及C4基因获得与维管束鞘细胞特性相关的顺式元件，从而利用了C3和C4叶片各细胞类型间稳定的转录因子模式化机制。
2、重新定义维管束鞘的功能
C4光合作用的多次独立演化重新定义了维管束鞘的功能，使其能够执行光合作用。然而，这种细胞类型在转录层面发生了多大程度的变化尚不清楚。为了理解水稻和高粱不同细胞类型间的转录特性差异，我们构建了光合作用组织的泛转录组图谱，该组织采样于光照48小时后。通过识别高粱和水稻的同源基因并将两种植物的细胞核聚类在一起，我们实现了这一目标。尽管水稻和高粱之间存在较大的演化距离，不过大多数细胞类型仍然聚类在一起（图2a）。最显著的例外是维管束鞘细胞，其细胞核在高粱和水稻中分别形成独立的簇（图2a及扩展数据图5）。支持这一观察的GO富集分析表明，C3和C4植物的维管束鞘细胞具有不同的功能——水稻维管束鞘中表达的基因主要与物质运输和定位相关，而高粱中则与有机酸代谢及前体代谢物和能量的生成相关（补充表1）。
图2：水稻和高粱维管束鞘细胞在转录分区中的保守性较低
a，基于同源基因的水稻和高粱细胞核泛转录组图。UMAP显示水稻（上）和高粱（下）的细胞核。黑色圆圈标示的区域为高粱维管束鞘细胞核，这些细胞核未与水稻的细胞核聚类。
b，高粱NADP-ME基因及其水稻同源基因的转录丰度。以UMAP形式显示，数据来源于a。
c，标志基因细胞类型分区变化的桑基图。高粱叶肉细胞和维管束鞘细胞类型的标志基因分别以绿色和蓝色高亮显示。BS：维管束鞘；E：表皮；GC：保卫细胞；M：叶肉；P：韧皮部；X：木质部。
d，水稻和高粱叶肉与维管束鞘细胞中差异表达的同源基因对。基因分为两类：一类是一致分区基因（在水稻和高粱中均在相同细胞类型中高表达）；另一类是差异分区基因（从一种细胞类型切换到另一种）。每一类别相关的GO术语显示在右侧。
在高粱维管束鞘中特异表达的180多个基因在水稻中仅弱表达或不具有细胞特异性（补充表4）。例如，典型的C4基因NADP-ME在高粱维管束鞘中表现出强烈的特异性表达，而在水稻中表达较弱且无细胞特异性（图2b）。类似的高水平局部表达模式也出现在高粱维管束鞘的其他与光合作用、光呼吸和叶绿体功能相关的基因中（扩展数据图5及补充表4）。此外，高粱的C4维管束鞘失去了与水稻维管束鞘相关的一些基因的表达（扩展数据图5及补充表4），其中包括激素信号传导和生物合成（如赤霉酸、乙烯和生长素通路）以及编码糖和水分运输蛋白的基因。
接着，我们研究了细胞类型特异性基因表达模式在物种间的保守程度（补充表5）。虽然大多数细胞类型在水稻和高粱之间表现出保守的表达模式，但维管束鞘是一个例外（图2c及扩展数据图5）。事实上，仅有31个同源基因（在水稻维管束鞘229个标志基因中）在两种植物的维管束鞘中特异表达，这些基因包括硫代谢和运输相关的基因（图2c及补充表5）。高粱的C4维管束鞘还获得了其他细胞类型的基因表达模式（图2c）。实际上，高粱维管束鞘在转录上与水稻的叶肉细胞和保卫细胞更相似，而水稻的维管束鞘细胞与高粱的韧皮部细胞更为相似（图2c及扩展数据图5）。这种相似性主要由与Calvin–Benson–Bassham循环和淀粉代谢相关的基因表达变化驱动（补充表5）。
由于光合作用基因在叶肉细胞与维管束鞘之间的差异表达（以下简称“分区”）被认为是C4光合作用演化的关键，我们对这一现象进行了研究。在对基因表达对光响应的两两比较中发现，每种植物中都有超过1000个基因在叶肉和维管束鞘细胞间发生了分区表达，其中包括225个同源基因（扩展数据图5及补充表6）。其中，126个基因在两种植物的相同细胞类型中表现出一致的分区模式（图2d）。值得注意的是，还有99个基因在两种植物中表现出相反的分区模式，即“差异分区”（图2d）。例如，有43个基因从水稻叶肉细胞的强表达状态转变为高粱维管束鞘的强表达状态，包括Calvin–Benson–Bassham循环、有机酸和氮代谢相关的基因；而56个基因从水稻维管束鞘的强表达转变为高粱叶肉细胞的强表达，这些基因主要与代谢物和溶质的运输相关（图2d及补充表6）。此外，12%的同源基因群表现出更复杂的表达模式（扩展数据图5）。
为了研究所有细胞类型之间的分区保守性，我们评估了不同细胞类型对跨物种基因分区的重叠程度。结果显示，叶肉细胞和维管束鞘在物种间的分区基因数量最少，统计重叠最弱（扩展数据图6及补充表7）。除了水稻叶肉和维管束鞘在转录分区方面的保守性最低外，还可以明显观察到，大量分区基因在这两种细胞间发生了细胞类型的“转换”（扩展数据图6）。这表明，其他细胞类型之间功能或“身份”转换在整个基因组范围内是罕见的，但在叶肉细胞和维管束鞘之间却相对频繁。
3、C4维管束鞘的光调控
由于光诱导光形态建成，我们研究了每种细胞类型的单个细胞核如何响应这一刺激。水稻的叶肉细胞和高粱的维管束鞘细胞根据采样时间点形成聚类，表明光是转录状态的主要驱动因素（图3a，b）。典型标志基因显示出预期的诱导模式，例如，RBCS在水稻叶肉细胞中被光激活，而NADP-ME在高粱维管束鞘细胞中被激活（图3a，b）。类似地，与光信号传导相关的转录因子如ELONGATED HYPOCOTYL（HY5）和PHYTOCHROME INTERACTING FACTORS 3–5（PIF3、PIF4和PIF5）的转录丰度在去黄化过程中发生动态变化（扩展数据图7）。我们通过拟合统计模型到伪汇总的转录谱，检测到细胞类型特异性的全局差异性基因表达响应。在水稻中，六种细胞类型中的每一种均显示出独特的且细胞类型特异性的响应（扩展数据图7及补充表8）。除了水稻中的维管束鞘和表皮细胞外，检测到数百个细胞类型特异性的光响应基因（扩展数据图7）。在两种植物中，叶肉和维管束鞘特异性基因均参与光合作用和叶绿体相关功能，与芽组织的快速绿化和白色体向叶绿体的转化一致（补充表8）。水稻和高粱的维管束鞘细胞对光的响应差异最大，其中水稻中仅检测到35个光响应维管束鞘特异性基因，而高粱中维管束鞘检测到超过1,000个基因（扩展数据图7）。
图3：光照改变细胞类型特异性转录丰度和染色质可及性
a，水稻叶肉细胞核的亚聚类（去黄化过程中）。右侧显示RBCS1A基因的转录丰度。
b，高粱维管束鞘细胞核的亚聚类（脱黄化过程中）。右侧显示NADP-ME基因的转录丰度。
c, d，不同细胞类型中光合作用基因表达的热图。c显示水稻，d显示高粱，数据来自光照前12小时。编码C4光合作用、Calvin–Benson–Bassham循环和光反应相关蛋白的基因分别以红色、紫色和黄色表示。
e, f，光合作用基因在不同细胞类型中染色质可及性的差异。e为水稻，f为高粱，分别在0小时（黑暗）和12小时（光照）测量。图中标注了Welch’s t检验结果。
光诱导的光合作用基因在叶肉细胞与维管束鞘间的分区表达显而易见（图3c，d及补充表9）。在水稻中，光合作用基因在叶肉细胞中最强烈地诱导，但在维管束鞘和其他细胞类型中也观察到较弱的响应（图3c）。扫描电子显微镜（SEM）证实，在黑暗中，白色体存在于维管和表皮细胞中，而在光照后，可观察到类囊体样的膜结构（扩展数据图8），支持了光合作用可在这些细胞类型中被弱诱导的观察结果。在高粱中，光在叶肉和维管束鞘细胞中强烈诱导了光合作用基因，这些基因包括与光依赖反应、Calvin–Benson–Bassham循环以及C4循环相关的重要基因（图3d）。与这些数据一致，光合作用基因的染色质在叶肉细胞中比其他细胞类型更为开放（P = 9.7 × 10⁻¹⁶，Welch's t检验）（图3e，f）。尽管在水稻叶肉细胞中染色质可及性对光的响应差异仅略显著（P = 0.053），但在高粱中，光合作用基因的染色质可及性在叶肉和维管束鞘细胞中均显著增加（P < 4.69 × 10⁻¹⁰）（图3f）。这些数据表明，高粱维管束鞘中光合作用基因对光调控的广泛获得可能通过染色质可及性的增加得以促进。
4、细胞特效调控基因表达
在水稻和高粱中，叶肉细胞与维管束鞘细胞之间的光合作用基因表达差异随时间增加（图3c，d）。例如，GLYCOLATE OXIDASE（GLO）和RBCS基因的转录在光照条件下分别更集中于水稻的叶肉细胞和高粱的维管束鞘细胞（图4a及扩展数据图9）。在光照12小时后，水稻中有72个光合作用基因，高粱中有77个基因在叶肉细胞和维管束鞘细胞之间发生分区（扩展数据图9）。然而，对于某些光合作用基因，在黑暗中细胞间的表达差异已经显现，这表明细胞特效能够影响光响应。具体来说，在黑暗中，分别有29%和58%的水稻与高粱光合作用转录物在叶肉细胞和维管束鞘细胞之间显著分区（图4b）。这一发现与光合作用基因启动子在黄化状态下包含开放染色质区域的观察一致（图3e，f）。事实上，在黄化状态下，许多光合作用基因在细胞类型之间表现出染色质可及性差异，例如GLO和RBCS基因（图4c及扩展数据图9）。在许多情况下，光照进一步增加了染色质可及性，这表明光信号可以增强但并非建立光合作用基因启动子内的染色质可及性（扩展数据图9）。我们推断，在C3水稻和C4高粱中，细胞特效的内在差异促成了光合作用基因表达在细胞之间的分区，而这种差异并非完全由光信号驱动。
图4：细胞特性和光照共同驱动光合作用基因在叶肉细胞与维管束鞘细胞间的分区表达
a，光呼吸基因GLO在水稻和高粱叶肉细胞及维管束鞘细胞中的转录丰度（去黄化过程中）。点表示平均表达值，线条通过局部散点平滑估计拟合。
b，在黄化条件下（0小时时间点）显著分区至叶肉细胞（M）或维管束鞘细胞（BS）的基因火山图。（调整P < 0.05，似然比检验）。编码C4光合作用、Calvin–Benson–Bassham循环和光反应相关蛋白的基因分别以红色、紫色和黄色表示。
c，GLO基因在0小时（黑暗）和12小时（光照）叶肉和维管束鞘细胞核中的染色质可及性。
d，水稻和高粱不同细胞类型中与开放染色质相关的顺式元件的重叠情况。（Fisher精确检验调整P值如图所示）。每种重叠中最过度富集的顺式元件共识基序显示在右侧（更多富集基序见补充表10）。
e，水稻和高粱不同细胞类型对光响应的开放染色质相关顺式元件的重叠情况。（Fisher精确检验调整P值如图所示）。所有重叠中最过度富集的顺式元件共识基序显示在右侧（更多富集基序见补充表12）。
5、C4途径利用了祖先顺式调控程序
顺式元件在驱动基因表达模式中起了关键作用。因此，我们进一步寻找支持所观察到的细胞特效和光依赖基因表达模式的顺式元件。当评估特定细胞类型开放染色质区域中的转录因子结合位点时，我们发现每种细胞类型均存在几十种富集的顺式调控元件（补充表10）。我们比较了两种植物每种细胞类型中25个最显著富集的顺式调控基序，发现同一细胞类型在水稻和高粱中共享显著的富集基序（图4d及补充表10）。这表明两种植物共享保守的细胞类型特异性顺式调控元件。例如，Myb-related、NAM、ATAF1、ATAF2和CUC2（NAC）转录因子结合基序定义了水稻和高粱叶肉细胞核的可及染色质区域，而DOF基序在两种植物的维管束鞘和韧皮部特异性峰中富集（图4d及扩展数据图10）。此外，我们在其他C3禾本科物种（如Chasmanthium laxum、大麦（Hordeum vulgare）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon））中检测到水稻和高粱维管束鞘分区基因的同源基因启动子区域中的DOF基序富集（扩展数据图10及补充表11）。相反，当我们检查响应光信号差异可及的染色质基序时，发现无论细胞类型如何，相同的基序均表现出富集。这些基序包括光响应的昼夜节律相关basic leucine zipper（bZIP）和CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）基序（图4e，扩展数据图11及补充表12）。这些发现表明，细胞类型特异性的基因表达模式由细胞特性相关的顺式元件定义，而光响应的基因表达则由所有细胞类型共享的顺式元件调控。
接着，我们研究了与每种细胞类型相关的顺式元件是否调控了水稻和高粱间分区差异的基因。我们分析了水稻叶肉细胞中优先表达但其同源基因在高粱维管束鞘中分区的基因（图5a）。这类40个同源基因包括Calvin–Benson–Bassham循环相关基因（如FRUCTOSE BISPHOSPHATE ALDOLASE和GLYCERALDEHYDE 3-PHOSPHATE DEHYDROGENASE，GAPDH）、光呼吸基因（如GLO）以及光反应基因（如LHCII亚基）（图5a及补充表13）。值得注意的是，在这些差异分区基因中，我们发现其相关染色质在水稻叶肉细胞特异基因中富集了Myb-related、high-mobility group（HMG）、REVEILLE 5（RVE5）和DF1结合位点（图5a），而在高粱维管束鞘特异性同源基因中则富集了DOF和JACKDAW（JKD）或indeterminate domain（IDD）结合位点（图5a，扩展数据图12及补充表13）。这表明，这些同源基因通过改变与自身特性相关的顺式调控基序，从叶肉细胞分区转变为维管束鞘分区。具体而言，我们的数据表明，从C3水稻叶肉细胞转移到C4高粱维管束鞘表达的基因获得了DOF基序。
图5：C3水稻和C4高粱的细胞类型特异性顺反组驱动光合作用在叶肉细胞与维管束鞘细胞间的分区
a，水稻和高粱中差异分区的同源基因的基因表达热图（左）及其对应基因开放染色质中最富集的四个顺式元件（右）。更多富集基序见补充表13。
b，不同物种中DOF转录因子在叶肉细胞和维管束鞘细胞中的表达。高粱基因名称基于其与水稻基因的同源关系。
c，水稻（橙色）和高粱（蓝色）的DOF转录因子对高粱GAPDH启动子和水稻最小SIR启动子的转录激活作用。（单侧Welch’s t检验，P值如图所示；n = 4个生物学重复；箱线图显示第25、第50（中位数）和第75百分位数；箱线延伸至1.5倍四分位距范围内的最远值；测定重复三次，结果一致）。
d，转基因水稻中由最小SIR启动子（含有两个DOF基序）驱动的GUS报告基因活性。使用荧光4-甲基伞形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷酶（4-MUG）分析法测定（左）。DOF基序突变用C替换AAAG中的G（单侧Welch’s t检验，P值如图所示；最小SIR启动子n = 29个独立转化体；突变DOF基序n = 23个独立转化体）。右侧显示了GUS染色的转基因叶片代表性横切面图，维管束鞘细胞用虚线标出。比例尺为50 µm。
e，通过获得DOF顺式元件，C4基因协同并放大了两种物种中共有的祖先维管束鞘细胞特性网络。
DOF结合基序的核心序列是AAAG（ref. 36）。因此，我们进一步分析了这些核心结合基序在转录起始位点附近1,500个核苷酸范围内的开放染色质中的频率，特别针对那些表现出差异性分区的基因。在这些基因中，与水稻同源基因相比，高粱中开放染色质中DOF结合位点的数量更多（双项检验P = 5.5 × 10⁻³；扩展数据图12）。相比之下，对于在两种植物中均表现出一致分区的基因，我们未发现这种富集现象（P = 0.48；扩展数据图12）。这一趋势在高粱维管束鞘中表达的典型光合作用基因中也有所体现。例如，与水稻同源基因相比，高粱GAPDH基因的开放染色质中包含的DOF基序数量多出两倍以上，而类似的DOF基序富集也出现在高粱C4光合作用基因（如NADP-ME）的开放染色质中（扩展数据图12）。
此外，DOF家族转录因子编码基因通常在水稻和高粱的维管束鞘细胞中更强烈地表达（图5b），这表明在从C3到C4的转变过程中，这些转录因子的细胞类型分布模式没有发生变化。为了测试DOF转录因子是否足以调控维管束鞘特异性基因的表达，我们在水稻原生质体中进行了效应测定。结果显示，水稻的OsDOF8和OsDOF27，以及高粱的SbDOF17、SbDOF8和SbDOF11能够激活源自高粱GAPDH启动子的荧光素酶（LUCIFERASE）报告基因的表达，而OsDOF2、OsDOF23和SbDOF2则没有激活作用（图5c）。类似地，一些水稻和高粱的DOF转录因子能够激活高粱NADP-ME启动子的表达（扩展数据图12），以及驱动水稻维管束鞘表达的最小OsSIR启动子（图5c）。当在这一最小OsSIR启动子中突变两个DOF结合位点时，稳定转化水稻植株的GUS活性降低了2.8倍（图5d）。这些数据表明，DOF家族的特定成员足以驱动强烈的维管束鞘特异性表达，而其对应的基序是必需的。
基于我们的分析，我们提出了一个模型来解释C4叶片中光合作用基因细胞类型特异性调控的重新编排（图5e）。该模型提出：
1. 水稻和高粱中相同的叶肉和维管束鞘特异性顺式元件均处于活跃状态；
2. 两种植物中转录因子的分布模式相对稳定；
3. 高粱维管束鞘中表达的光合作用基因获得了与水稻维管束鞘细胞相关的DOF顺式元件，从而在该细胞类型中增强表达。
讨论
我们的研究表明，C4基因在维管束鞘细胞中的表达依赖于祖先C3状态的两个特性整合：第一，保守的细胞类型特异性转录因子网络；第二，祖先细胞特性顺式元件的获得。在C3水稻和C4高粱中，DOF转录因子均优先在维管束鞘中表达，这一发现有力地支持了C3和C4物种间转录网络稳定性的观点。C4基因启动子中DOF结合位点的获得使这些基因能够解读已有的转录因子模式，从而在维管束鞘中增强表达。这一机制通过拓展细胞特性网络，促进了C4光合作用的演化。
值得注意的是，在C4玉米中，与维管束鞘特异性基因相关的DOF基序同样表现出富集现象。瞬时分析表明，DOF转录因子控制诸如玉米NADP-ME等维管束鞘特异性基因的表达。这表明，DOF介导的维管束鞘基因表达调控机制存在于多种C4物种中。此外，DOF基序不仅在C3水稻的维管束鞘特异性基因中表现出富集，还存在于PACMAD分支中其他由的C3物种（如Chasmanthium laxum），以及禾本科的两种C3植物（如大麦和二穗短柄草）的同源基因中。这些结果支持了一个模型，即DOF对维管束鞘表达的调控具有祖先性，并在C4演化过程中被用于强化C4基因在维管束鞘中的表达。
与之前的分析相比，我们提出的模型支持一种通往C4状态的独特演化路径。例如，在C4双子叶植物中，已有研究报告称，维管束鞘和叶肉细胞特异性基因表达是通过现有顺式元件介导的，这些元件允许转录网络的变化被解读。与之前关于单子叶植物的研究相比，我们能够为C3植物和C4植物中与维管束鞘特性相关的顺式元件提供见解，从而对细胞特异性基因表达的演化重构提供了独特的视角。由于我们采用了一种无偏的全基因组方法，这种顺式元件的重构可能构成了C4演化过程中顺式元件最显著的变化之一。结合先前的分析，这些研究表明，已有的与光响应元素相关的顺式元件的获取可以增强C4基因在C4植物相较于C3植物叶片中的表达，我们的数据支持通过顺式元件的广泛重构来反复利用现有的转录程序。
这些发现对当前将C4光合作用特性引入C3植物的工程化项目具有重要意义。例如，为水稻中部署C4光合作用的生化路径已付出了相当大的努力。然而，迄今为止的主要障碍是C4酸脱羧酶基因在水稻维管束鞘中的稳定表达。本文的数据显示，通过重构这些基因以识别基于DOF转录因子的古老维管束鞘特性网络，可能为实现这一目标提供了一条有前景的途径。
数据获取
原始数据和处理后数据（包括组装的图谱）已存储于Gene Expression Omnibus，并可通过[GSE248919](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE248919)公开获取。叶绿素定量、转录激活实验和GUS定量的原始数据已存储于Mendeley，链接为：(https://doi.org/10.17632/6xmsdg9xcr.1)。
本文中报告的显微镜数据可通过联系J.M.H.获取。如需重新分析本文中报告的数据的其他信息，也可向J.M.H.提出请求。
代码获取
本文中所涉及的生物信息学分析代码可在GitHub上获取，链接为：https://github.com/joey1463/C3-C4.git
附审稿意见
审稿人 #1：
这是一篇令人兴奋且撰写精良的论文，利用了多种全基因组转录和染色质可及性分析方法，探讨了叶片中特定组织如何获得新功能以执行光合作用反应。关于组织如何获得新功能，目前存在几种普遍的进化模型，其中一些依赖于新的反式因子的创新。在本文中，作者基于数据讲述了一个令人信服的故事，表明通过在C4基因启动子中获取细胞类型特异性（DOF）转录因子结合位点，这些基因的表达能够被整合进已有的转录因子模式，从而在维管束鞘细胞中实现表达。尽管仍存在其他解释的可能性，但这项工作提供了一个概念上引人入胜的观点，并伴随了一些技术上令人印象深刻的数据。
我只有一些需要通过修改文本和图表（或许不同的数据分析）来解决的意见，不需要新增数据。
……
审稿人 #2：
关键结果摘要：在这篇稿件中，作者结合单细胞RNA测序和ATAC测序，研究了C4光合作用进化过程中关键的转录重构机制。他们发现，C4植物高粱通过利用现有的调控网络激活维管束鞘细胞中的光合作用基因，这一创新对这种更高效的光合作用形式至关重要。
我发现这篇手稿非常有趣，实验设计优雅，科学结果令人激动且严谨，提供了关于植物中最重要生物学途径之一的洞见。所使用的方法非常适合研究作者提出的问题，分析方法恰当，结果通过图表清晰呈现。
我确实认为，作者可以进一步使文章对非植物科学家更具可读性。这类读者可能会因为不了解光合作用在不同细胞类型中的定位为何重要，而难以认识到研究结果的意义。作者在引言中讨论了这一点，但我建议在文章开头增加一个图表，广泛概述C3与C4光合作用的差异，以帮助不熟悉该过程的读者更好地理解。这将很好地铺垫图5D的内容，后者总结了主要研究发现。
此外，我还有一些其他小的意见和问题。
……
审稿人 #3：
这是一项重要且令人兴奋的研究，设计精巧，执行出色，描述清晰。尽管部分技术细节超出了我的专业范围，但由于解释清楚，我仍然能够很好地理解。该研究的结果不仅对于理解C4光合作用的进化至关重要，同时也对更广泛的进化创新提供了重要见解。
本文提出的基本问题是，在C4进化过程中，维管束鞘细胞如何被招募为植物叶片中主要的碳固定细胞。通过对高粱（C4）和水稻（C3）的单细胞RNA表达分析，作者发现Calvin循环核心基因以及一个关键脱羧酶基因在高粱中获得了关键的顺式元件基序，这些基序是维管束鞘特性网络的一部分，由DOF家族转录因子调控。作者推测，这一细胞特性网络具有祖先性，因为它同样调控水稻中维管束鞘的发育。因此，高粱利用了一个预先存在的维管束鞘身份模块，整合了关键光合作用基因的细胞特异性表达，这是功能性C4循环必不可少的。作者将这一结果与其他关于双子叶植物的研究进行了对比，后者表明转录因子本身的空间表达发生变化，而顺式元件是保守的。
……
审稿人 #4：
本文描述了在两种禾本科作物（稻和高粱）中生成互补的高质量数据集，以研究控制C3和C4光合作用的分子信号级联通路。基于利用先进的单细胞组学方法获得的高分辨率转录和染色质可及性分析，本文对幼苗在光形态建成过程中的基因表达和染色质状态动态变化进行了表征。通过已知和新发现的标志基因进行比较分析，对不同聚类进行注释，代表不同的细胞类型（包括验证维管束鞘报告基因系）。随后，通过基因同源信息的比较分析，聚焦于在光合作用路径中发挥关键作用的两种细胞类型——叶肉细胞和维管束鞘细胞，揭示了基因表达的相似性和差异性。
对两种物种基因表达差异的分析，划定了一组显示分区差异的基因，这些基因很可能对C3和C4途径之间的差异作出贡献。对光照和黑暗条件下染色质可及性的分析证实了光合作用基因调控中的主要差异，表明细胞身份和相关顺式元件负责光合作用基因的分区表达。综上，作者提出了一个模型，认为稻（C3）和高粱（C4）之间的主要区别在于高粱光合作用基因中获得了维管束鞘表达相关的DOF顺式元件。
本稿件以一段优秀的引言开篇，概述了C3和C4光合作用在植物中的重要性及其主要差异。转录和染色质可及性分析的结果描述清晰，图表和扩展数据图很好地报告了这一复杂跨物种数据集中的主要趋势，尽管某些情况下图例过于简略，无法充分理解各个小图中显示的结果。
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公开代码获取，按照序号编排（部分）
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Cite this article
Swift, J., Luginbuehl, L.H., Hua, L. et al. Exaptation of ancestral cell-identity networks enables C4 photosynthesis. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08204-3
| Received
26 January 2024
| Accepted
11 October 2024
| Published
20 November 2024
