亮点
• 构建了高质量的泥鳅（呼吸空气的鱼类）单倍体基因组
• Mex3a基因起源于古代的呼吸空气鱼类
• Mex3a的缺失通过抑制血管生成，削弱了泥鳅的空气呼吸能力
• 古老的mex3a是鱼类空气呼吸基因
摘要
鱼类呼吸空气的方式对脊椎动物从水生环境向陆生环境的转变至关重要。迄今为止，参与鱼类空气呼吸的基因尚未得到充分识别。在本研究中，我们对泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus，一种能呼吸空气的鱼类）和非空气呼吸鱼类——西藏高原鳅（Triplophysa tibetana）进行正选择基因（PSG）的基因富集分析，并进行了泥鳅的单倍型基因组组装以及空气呼吸和非空气呼吸鱼类的基因进化分析。我们发现正选择基因mex3a起源于古代的呼吸空气鱼类。Mex3a的缺失通过与T-box factor 20的相互作用抑制血管生成，从而削弱泥鳅的呼吸空气的能力。Mex3a的过表达显著促进了血管生成。结构分析和点突变研究揭示了泥鳅Mex3a中第201个氨基酸在血管生成中起到了关键作用。我们的研究创新性地表明，mex3a起源于古老的鱼类空气呼吸基因，这对理解鱼类空气呼吸具有重要意义，并为培育耐缺氧鱼类品种提供了宝贵资源。
背景介绍
生命的进化是一个充满变革与奇迹的过程。作为最古老的脊椎动物，鱼类经历了复杂的进化历程，最终促成了人类的出现。在众多变化中，鱼类呼吸空气的出现是一个关键的适应性创新，促成了它们从水生环境向陆生环境的转变，使其摆脱了水的限制。目前已有约400种能呼吸空气的鱼类被报道。对它们的空气呼吸器官（air-breathing organs，ABOs）的组织学观察显示，高血管化（high vascularization）和薄血气屏障（a thin blood-gas barrier）构成了鱼类空气呼吸的结构基础，这表明血管生成与空气呼吸能力之间存在紧密联系。
对非洲肺鱼（能够呼吸空气的肉鳍鱼类）的基因组研究揭示，硬骨鱼类的古代祖先已经具备了初步的空气呼吸能力。对非硬骨鱼类（如塞内加尔多鳍鱼（Polypterus senegalus）、匙吻鲟（Polyodon spathula）、弓鳍鱼（Amia calva）和鳄雀鳝（Atractosteus spatula））的深入比较基因组学分析，揭示了一些与肺部发育和血管生成相关的古老基因，这些基因在鱼类空气呼吸的进化中发挥了关键作用，带来了遗传和功能上的创新。对能够呼吸空气的蟾胡子鲶（Clarias batrachus）的基因组分析显示，与血管生成及氧气结合和运输相关的某些基因发生了扩张，以满足其陆生生活的空气呼吸需求。在印度鲶鱼（C. magur）中，血管发育和血管生成相关的基因经历了正选择，以提高其空气呼吸能力。此外，基于乌鳢（Channa argus）的鳃及腮上腔（suprabranchial chamber）（空气呼吸器官）的转录组学分析，研究人员发现与血管生成相关的一些基因（如血管内皮生长因子[vegf]）在空气呼吸器官中高表达。根据我们之前对泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）后肠（posterior intestine）（空气呼吸器官）的转录组学分析，我们也筛选出了一些与血管生成相关的基因。迄今为止，基于具有空气呼吸能力的单一鱼类的基因组分析、多个非硬骨鱼类的比较基因组学分析以及鱼类空气呼吸器官的转录组学研究，一些与血管生成相关的基因已被筛选出来，然而，这些基因还未被确认为鱼类空气呼吸基因。
CRISPR-Cas9基因编辑技术使基因敲除（KO）变得更加精确和高效。这一技术使研究人员能够通过观察表型变化来探索基因在生物体内的功能。与肺鱼和斑点雀鳝相比，泥鳅是揭示鱼类空气呼吸分子机制的绝佳模型，因为在该物种上已成熟应用CRISPR-Cas9编辑技术，且其繁殖能力强。因此，利用这一模型，我们能够有效揭示鱼类空气呼吸形成的复杂机制，从而深入了解鱼类向陆地转变的进化历程。
在我们之前的研究中，与非空气呼吸鱼类——西藏高原鳅（Triplophysa tibetana）的比较中发现了泥鳅（M. anguillicaudatus）中有120个正选择基因（PSGs）。在这些正选择基因中，可能存在与空气呼吸相关的基因。本研究结合了正选择基因的基因富集分析、高质量泥鳅单倍型基因组组装以及包含肉鳍鱼类和辐鳍鱼类（硬骨鱼和非硬骨鱼）物种的空气呼吸和非空气呼吸鱼类的基因进化分析，筛选出与泥鳅肠道空气呼吸相关的mex-3 RNA结合家族成员a（mex3a）基因。为了进行功能分析，我们利用CRISPR-Cas9技术在泥鳅和血管可视化的斑马鱼（Danio rerio，一种不具空气呼吸的模式鱼）中构建了mex3a缺失模型。同时，进行了呼吸生理实验、转录组学分析、蛋白质相互作用分析、基因过表达（OE）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的基因敲低（KD）实验。此外，通过蛋白质结构分析、外源表达和点突变确定了与空气呼吸相关的血管生成中Mex3a的功能位点。最后，古老的mex3a被确认作为鱼类空气呼吸基因。我们的发现为理解鱼类空气呼吸的进化提供了宝贵的见解，该基因帮助鱼类在水陆转变过程中适应环境。此外，我们为培育耐缺氧鱼类品种提供了一种新的遗传资源。
结果
筛选与血管生成相关的基因
针对正选择基因开展的基因富集分析
针对与鱼类空气呼吸相关的基因，我们对之前研究中获得的120个正选择基因（PSGs）进行了功能富集分析，使用了GO术语和KEGG数据库（见图S1）。在这些正选择基因中，我们发现mex3a与血管（BV）形态发生（GO: 0048514）相关，热休克蛋白β-1（hspb1）与VEGF信号通路（ko04370）相关，骨形态发生蛋白（bmp4）与转化生长因子β（TGF-β）信号通路（ko04350）相关，血管生成素样蛋白4（angptl4）与参与血管生成的通路（GO: 0001525）相关。先前的研究表明，MEX3A可以通过糖酵解促进结直肠癌中的血管生成。Rezzola等人报道BMP4可以激活VEGFR2，从而引发血管生成反应。Lee等人发现，溶解性HSPB1通过直接相互作用调节VEGF介导的血管生成。Chaube等人报告称，抑制angptl4会重塑内皮细胞的代谢并抑制血管生成。Kushwaha等人认为，与血管发育和血管生成相关的正选择基因增强了印度鲶鱼的空气呼吸能力。因此，这四个与血管生成相关的基因的正选择可能有助于泥鳅的肠道空气呼吸（见表S1）。
泥鳅单倍型基因组组装
我们组装了高质量的泥鳅单倍型基因组以供后续分析。我们组装了两个单倍型：包含较长同源染色体的单倍型命名为“Mchra”，而另一个则命名为“Mchrb”。最终组装的Mchra和Mchrb基因组分别约为1.04 Gb和1.06 Gb（见表S2）。泥鳅的scaffold N50长度超过了西藏高原鳅（T. tibetana）、T. bleekeri和T. siluroides的N50长度（见表S3）。Mchra和Mchrb单倍型基因组通过BUSCO评估，完整性得分分别为97%和96.8%（见表S4）。此外，如表S5所示，Mchra单倍型基因组中的重复序列约占59.87%，而Mchrb单倍型基因组中的重复序列约占59.54%。我们的数据显示，Mchra和Mchrb单倍型到基因组分别注释了24,400个和24,544个蛋白编码基因（见表S6和S7）。为了确定染色体的方向性，我们在泥鳅和西藏高原鳅染色体中识别到了126 bp和128 bp的着丝粒序列，并据此调整了染色体至一致的方向（见图S2A；见表S8）。本研究获得的泥鳅着丝粒序列与之前报道的泥鳅着丝粒序列的相似性高达80%，这一结果是通过NCBI比对工具blastn进行的，表明本研究中泥鳅着丝粒序列的高准确性。根据着丝粒的位置，泥鳅的25条染色体被划分为三种类型（中央着丝粒染色体[M; n = 5]，亚中央着丝粒染色体[SM; n = 2]，和端着丝粒染色体[T; n = 18]），这与Li等人的先前报告一致。此外，圈图和基因组共线性分析显示了这两个泥鳅单倍型基因组特征的显著相似性（见图1和图S2B）。
图1 Mchra 和 Mchrb单倍型基因组特征圈图
为了识别参与泥鳅肠道空气呼吸的基因，我们对古空气呼吸鱼类（如斑点雀鳝[辐鳍鱼]和非洲肺鱼[肉鳍鱼]）及非空气呼吸的硬骨鱼（如青鳉、斑马鱼和西藏高原鳅）的基因组进行了进化分析，重点关注mex3a、bmp4、hspb1和angptl4基因。如图2所示，灰色线条代表这些鱼类物种之间的高度共线性的区块，这些保守的基因组区域展示了较为稳定的基因排列和顺序，表明这些基因在进化过程中得以保留。hspb1（黄线）、bmp4（绿线）和angptl4（蓝线）的进化分析显示，这些基因在非洲肺鱼和斑点雀鳝中未发现，表明这些基因在古空气呼吸鱼类中并不保守。而对于mex3a（红线），在非洲肺鱼、斑点雀鳝、斑马鱼、泥鳅和藏高原鳅之间存在高度相似的区块，表明mex3a从古空气呼吸鱼类中遗传下来。红线的缺失则表明mex3a的同源区在青鳉和斑马鱼中并不保守（见图2）。在鱼类进化过程中，硬骨鱼的祖先曾具备空气呼吸能力。许多古老基因为鱼类的空气呼吸提供了重要的遗传和功能创新，这些基因在进化过程中被后代继承并进一步发展。在泥鳅的四个正选择基因中，只有mex3a基因从非洲肺鱼和斑点雀鳝中继承下来，这表明mex3a基因较为古老，可能在鱼类空气呼吸中发挥了作用。
图2 mex3a, bmp4, hspb1和angptl4的进化分析
mex3a的功能分析
鱼类空气呼吸器官中的Mex3a表达
Mex3a是一种RNA结合蛋白，具有两个功能域：RNA结合KH域和RING指结构域。最近的研究表明，MEX3A通过PI3K/AKT信号通路与LAMA2（层粘连蛋白亚基α2）相互作用，调控肺腺癌细胞的转移。在骨肉瘤中，敲低（KD）MEX3A抑制了细胞增殖和迁移。在结直肠癌中，MEX3A可以通过糖酵解促进血管生成。目前已有研究证明，Mex3a在调控细胞增殖、侵袭和血管生成方面发挥了重要作用。然而，Mex3a是否参与鱼类空气呼吸仍然不清楚。
为了探讨mex3a在鱼类空气呼吸器官中的表达模式，选取了三种常见的空气呼吸硬骨鱼：乌鳢（空气呼吸器官：鳃上器官）、黄鳝（空气呼吸器官：口咽）和泥鳅（空气呼吸器官：后肠）（见图S3A–S3D）。当暴露于空气中时，这三种鱼类空气呼吸器官中的Mex3a表达显著上调，表明Mex3a参与了空气呼吸鱼类适应低氧环境的过程。随后我们对泥鳅mex3a的组织表达和定位进行了分析。结果显示，mex3a在泥鳅后肠中的表达水平最高（见图S3E）。早期发育信号也主要集中在泥鳅肠道区域（见图S3F）。原位杂交和免疫荧光进一步表明，Mex3a在泥鳅后肠黏膜层的毛细血管中强烈表达，同时在后肠的浆膜层中也有表达，而在前肠中的表达较少（见图S3G和S3H）。类似地，以前对空气呼吸鱼类（如非洲肺鱼、步行鲶、乌鳢和印度鲶鱼）的基因组和转录组研究也表明，一些参与血管生成的基因经过正向选择或在空气呼吸器官中高表达，可能参与了空气呼吸的过程。因此，我们的研究结果表明，古老的正选择基因mex3a与血管生成有关，参与了泥鳅肠道空气呼吸的过程。
mex3a基因敲除模型的构建
通过CRISPR-Cas9系统，我们在泥鳅中构建了mex3a基因敲除（KO）模型。如图S3I所示，野生型泥鳅（WT泥鳅）的mex3a基因包含两个外显子和一个内含子。我们针对第一个外显子进行了敲除，得到的突变体mex3a−/−（KO泥鳅）缺失了13bp（GCGAGGACAGCGG），导致氨基酸翻译提前终止（翻译59个氨基酸，误译57个氨基酸）。通过实时qPCR和蛋白质印迹（WB）验证，成功生成了缺失Mex3a的纯合泥鳅。
图3 WT泥鳅和KO泥鳅的生存时间、后肠结构变化和耗氧量分析
mex3a基因敲除降低了泥鳅的肠道空气呼吸能力
为了研究mex3a基因缺失对泥鳅肠道空气呼吸的影响，我们进行了空气暴露实验，并记录了WT和KO泥鳅的存活时间。结果显示，KO泥鳅的存活时间显著低于WT泥鳅（见图3A）。后肠的组织学分析表明，KO和WT泥鳅的肠道结构没有显著差异（见图S3J）。然而，KO泥鳅后肠中的血管数量略低于WT泥鳅（见图S3K）。此外，通过透射电子显微镜（TEM）对后肠的分析表明，KO泥鳅黏膜层中的红细胞（RBCs）数量显著少于WT泥鳅（见图3B和3C）。
为了更好地观察黄鳝后肠中血管的变化，我们利用黑色素瘤细胞粘附分子（MCAM；Cd146/MCAM）对血管进行了标记。我们发现，敲除型黄鳝（KO鳝鱼）后肠中的血管数量显著少于野生型黄鳝（WT鳝鱼）。此外，KO鳝鱼中参与血管生成的基因（如vegf、红细胞生成素（epo）、血红蛋白β链（hbb）和烯醇化酶3（eno3））的表达水平显著低于WT鳝鱼。空气暴露实验的这些结果表明，mex3a基因的缺失抑制了黄鳝后肠中血管的形成，导致KO鳝鱼在空气暴露下的存活时间缩短。
通过进一步的慢性缺氧实验，我们再次探讨了mex3a缺失对黄鳝肠道空气呼吸的影响。在慢性缺氧条件下，KO鳝鱼的空气呼吸频率显著低于WT鳝鱼，而其水中的耗氧量则显著高于WT鳝鱼。这些结果表明，KO鳝鱼的氧气摄取依赖于通过鳃呼吸水中溶解的氧。后肠血管的Cd146标记结果也显示，KO鳝鱼的血管数量显著少于WT鳝鱼。此外，KO鳝鱼中与血管生成相关的基因（如vegf、epo、hbb和eno3）的表达显著下调。这些结果再次强调了mex3a基因在黄鳝后肠血管生成中的重要作用，其缺失导致了黄鳝空气呼吸能力的下降。
WT与KO鳝鱼后肠的转录组分析
在生物体中，氧气作为一种趋化因子与血管生成直接相关。研究表明，适度的缺氧能够刺激血管生成，为了探讨mex3a对血管发育的调控机制，我们对空气暴露下黄鳝后肠进行了转录组测序。转录组分析显示，KO鳝鱼与WT鳝鱼相比，共有920个差异表达基因（DEGs），其中390个基因上调，530个基因下调。
进一步的GO富集分析表明，一些差异基因在“上皮褶皱形态发生”通路中富集，该通路在胚胎发育和组织形成中发挥关键作用，促进器官或结构的形态变化和结构建立。KEGG富集分析则发现，某些差异基因富集在“ECM-受体相互作用”通路中，该通路调节细胞粘附、信号传导、运动和组织建立等关键生物过程。差异基因的进一步分析显示，KO鳝鱼中已知与血管生成相关的基因（如T-box转录因子20（tbx20）、基质金属蛋白酶-9（mmp9）、mmp13、血管活性肠肽（vip）、血小板衍生生长因子（pdgf）、MAPK活化蛋白激酶2（mapkapk2）、层粘连蛋白亚基β3（lamb3）、血小板反应蛋白1（thbs1）和CD44分子（cd44））的表达显著下调。此外，qPCR分析进一步验证了选定差异基因在WT与KO鳝鱼后肠中的基因表达趋势与转录组数据一致，证明了数据的可靠性。为了深入探讨mex3a在血管生成调控中的分子机制，我们进行了免疫共沉淀（IP）分析。根据抗体质量和序列同源性，我们分别分析了Mex3a与Tbx20、Mmp9、Mmp13和Mapkapk2蛋白的相互作用。最终，IP分析揭示了Mex3a与Tbx20之间的相互作用。
研究报道表明，Tbx20在胚胎发育期间对心脏、神经细胞和血管等结构的调控起着关键作用。在小鼠胚胎中，Tbx20的缺失可能导致心血管系统的发育异常，甚至致死。此外，研究发现，血管周围脂肪干细胞具有促进血管重塑的潜力，Tbx20的过表达显著增强了这些细胞的分化能力。我们还验证了Tbx20-Prok2-Prokr1信号通路在黄鳝后肠中的表达水平。研究表明，Mex3a的缺失显著抑制了黄鳝Tbx20、Prok2和Prokr1基因的表达。黄鳝后肠的免疫荧光染色结果显示，Mex3a和Tbx20均在黄鳝的血管中表达。Mex3a缺失导致黄鳝Tbx20的表达显著减少，血管中几乎检测不到表达信号。研究还发现，在斑马鱼和小鼠中抑制Tbx20-Prok2-Prokr1通路的基因表达会引发血管损伤，而这些基因的过表达则能够修复血管损伤。我们的研究结果表明，Mex3a通过与Tbx20的相互作用，参与了Tbx20-Prok2-Prokr1信号通路，从而调控鱼类的血管生成。
mex3a参与鱼类血管生成
转基因斑马鱼（fli1a:EGFP）已经成为研究血管生成的不可或缺的实验工具。斑马鱼fli1基因的表达很广泛，其启动子能够在整个胚胎发育过程中驱动增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在所有血管中的表达。为了验证我们在黄鳝中的发现，我们利用fli1a:EGFP系斑马鱼建立了mex3a基因敲除模型。斑马鱼（fli1a:EGFP）mex3a基因由两个外显子和一个内含子组成。我们靶向敲除了第一个外显子，产生了一个mex3a−/−（KO斑马鱼）突变体，缺失了四个碱基（GGCG），导致了氨基酸翻译的过早终止。WB验证表明，成功获得了缺失Mex3a的纯合斑马鱼。
此外，组织表达分析显示，斑马鱼（AB系）mex3a基因主要在血管丰富的组织中表达，包括眼睛、鳃和大脑，而在肠道中的表达水平相对较低。与此同时，斑马鱼中mex3a基因的表达模式与黄鳝不同。斑马鱼肠道组织的免疫荧光分析表明，Mex3a在浆膜层高度表达，并在黏膜层中也有表达，这与黄鳝中的结果有所不同。通过血管可视化分析，我们观察到在受精后30小时（hpf）的mex3a敲除斑马鱼（fli1a:EGFP）腹部血管生长显著受抑，较WT斑马鱼（fli1a:EGFP）明显减少。此外，mex3a的缺失显著抑制了Tbx20、Prok2和Prokr1基因的表达。这些发现进一步证实了古老基因mex3a在血管生成过程中所发挥的重要作用。
图4 斑马鱼mex3a的组织表达分析及早期血管发育的观察
Mex3a在人脐静脉内皮细胞中的功能验证
血管生成是一个涉及内皮细胞增殖和迁移的复杂过程，由血管生成因子和细胞外基质共同调控。内皮细胞迁移是血管生成的早期步骤之一，是血管发育的重要标志。为了在体外模拟血管发育过程，通常采用内皮细胞迁移实验和三维血管形态发生模型来评估血管生成。人脐静脉内皮细胞常用于与缺氧、细胞迁移和肿瘤相关的血管生成研究中。为了验证Mex3a在血管生成中的调控作用，我们使用人脐静脉内皮细胞建立了Mex3a基因敲低（KD）和过表达（OE）模型。图S6A显示了Mex3a成功转染到人脐静脉内皮细胞中。
在常氧条件下的细胞迁移实验中，我们观察到，与对照组（CT组）相比，Mex3a敲低组（Mex3a-KD组）抑制了人脐静脉内皮细胞的迁移，而Mex3a过表达组（Mex3a-OE组）则促进了人脐静脉内皮细胞的迁移（图5A）。此外，对人脐静脉内皮细胞的管形成（tube-forming）实验显示，在12小时孵育时，Mex3a-KD、Mex3a-OE和CT组的管形成能力没有显著差异。然而，在24小时后，Mex3a-OE组的管形成能力显著强于CT组和Mex3a-KD组。在Mex3a-OE组中，大多数血管保持完整，仅有少量细胞死亡，而在CT组和Mex3a-KD组中，大多数血管无法维持完整性，出现大量细胞死亡（图5A）。通过qPCR、WB和免疫荧光，我们验证了人脐静脉内皮细胞中的TBX20-PROK2-PROKR1通路。结果显示，Mex3a KD显著抑制了TBX20-PROK2-PROKR1通路的表达，而Mex3a OE则显著促进了该通路的表达（图5B和5C）。免疫荧光结果表明，TBX20在Mex3a-KD组中表达明显受到抑制，而在Mex3a-OE组中表达显著增强（图5D）。
图5 Mex3a过表达和敲低对人脐静脉内皮细胞迁移和成管能力的影响
如图S6B-S6E所示，低氧处理抑制了人脐静脉内皮细胞的增殖。我们的研究结果表明，与鱼类类似，哺乳动物的Mex3a也具有通过TBX20-PROK2-PROKR1信号通路调控血管生成的能力。
泥鳅Mex3a突变N201S对人脐静脉内皮细胞迁移和管形成能力的影响
Mex3a的保守性分析
蛋白质的结构决定其功能。通过比较泥鳅、非洲肺鱼、草绳恐龙鱼（Erpetoichthys calabaricus）、大刺鳅（Mastacembelus armatus）、乌鳢（Channa argus）、斑纹隐小鳉（Kryptolebias marmoratus）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、鲤鱼(Labeo rohita)、斑马鱼、西藏高原鳅、拉蒂迈鱼（Latimeria chalumnae）和斑点雀鳝等物种的Mex3a氨基酸序列，发现Mex3a具有高度的保守性（图S6F），这表明Mex3a可能在鱼类中调控血管生成。我们疑问为何斑马鱼和西藏高原鳅无法在空气中生存。通过正选择分析，发现泥鳅Mex3a的第201位氨基酸（对齐序列后的位点为188位）发生了正选择和突变，进化成了天冬酰胺（N），而斑马鱼和西藏高原鳅的对应位点为丝氨酸（S）（图S6G；表S9）。蛋白质的一级结构决定其空间结构。通过预测Mex3a蛋白的三级结构，发现不同物种间的空间构象存在差异，包括非洲肺鱼、斑点雀鳝、黄鳝、乌鳢、泥鳅、西藏高原鳅、斑马鱼、小鼠和人，尤其是在RING-finger结构域中（图S6H-S6P）。先前研究表明，RING-finger结构域在调控细胞周期、迁移和基因转录等过程中至关重要，其缺陷往往与癌症的发生有关。在鲤形目中，西藏高原鳅（Tt）和斑马鱼（Dr）的蛋白质空间构象相似，但与泥鳅（Ma）相比，RING-finger结构域存在差异（图S6Q）。此外，当将泥鳅Mex3a第201位氨基酸由天冬酰胺（201N）突变为丝氨酸（Ma_N201S）后，Mex3a蛋白在RING-finger结构域的构象变得与西藏高原鳅和斑马鱼相似（图S6R）。进一步分析泥鳅Mex3a 201N、西藏高原鳅201S、斑马鱼197S和泥鳅Mex3a N201S周围的氨基酸构象，发现斑马鱼197S的构象与泥鳅201N、西藏高原鳅201S和泥鳅Mex3a N201S的构象不同（图S6S-S6U）。泥鳅201N与西藏高原鳅201S构象的差异与周围氨基酸形成的氢键数量不同有关（图S6S和S6T）；N201S的构象更接近于西藏高原鳅201S（图S6T和S6V）。我们的研究结果表明，泥鳅Mex3a蛋白第201位氨基酸的变化（N或S）可能影响其空间结构，从而可能导致功能上的变化。
外源泥鳅和斑马鱼Mex3a基因对人脐静脉内皮细胞迁移和管形成的影响
通过细胞迁移实验发现，与对照组（egfp）相比，泥鳅（mex3a-Ma组）和斑马鱼（mex3a-Dr组）的Mex3a均能在常氧条件下促进人脐静脉内皮细胞的迁移和管形成。然而，泥鳅和斑马鱼之间并无显著差异（图6A，上方）。缺氧是诱导血管生成的主要因素之一。此外，通过缺氧诱导，在人脐静脉内皮细胞迁移方面，我们发现与mex3a-Dr组和egfp组相比，mex3a-Ma组的细胞密度更高，且其细胞迁移距离更长。mex3a-Ma组在管形成的完整性和密度方面也高于mex3a-Dr组和egfp组（图6A，下方）。这些研究结果表明，泥鳅和斑马鱼的Mex3a基因均能在常氧和缺氧条件下增强人脐静脉内皮细胞的迁移和管形成能力。此外，泥鳅Mex3a在缺氧条件下的促进作用比斑马鱼更为显著。古老的Mex3a的正选择代表了一种通过增强泥鳅的空气呼吸能力对陆地环境的适应策略。
图6 人脐静脉内皮细胞的迁移和血管形成能力
在低氧条件下，泥鳅Mex3a表现出更强的促进人脐静脉内皮细胞迁移和管形成的能力。这表明Mex3a在第201位的天冬酰胺（201N）是泥鳅和斑马鱼在人脐静脉内皮细胞迁移和管形成方面的主要区别因素。此外，我们在人脐静脉内皮细胞中建立了泥鳅Mex3a突变模型（N201S），该模型显示出与斑马鱼Mex3a类似的趋势，能够促进人脐静脉内皮细胞的迁移和管形成（图6B）。这些发现表明，Mex3a蛋白的201位氨基酸残基（201N）是泥鳅和斑马鱼在促进血管生成方面的关键区别因素。
结论
在本研究中，我们组装了两份高质量的泥鳅单倍型基因组，并对含有硬骨鱼和肉鳍鱼（包括硬骨鱼和非硬骨鱼）物种的空气呼吸与非空气呼吸鱼类进行了基因进化分析，筛选出与空气呼吸相关的mex3a基因。随后通过基因敲除（KO）、基因敲低（KD）和基因过表达（OE），呼吸生理实验、转录组分析、蛋白质相互作用/结构分析等，我们发现Mex3a的缺失抑制了血管生成，削弱了泥鳅的空气呼吸能力。此外，泥鳅Mex3a的第201位氨基酸直接与其在血管生成中的作用相关。最终，我们创新性地将古老的mex3a基因鉴定为鱼类空气呼吸基因。我们的研究结果为鱼类空气呼吸的进化提供了新的见解，并为开发具有耐低氧特性的鱼类新品种提供了重要的理论基础。此外，有研究表明，人类是由鱼进化而来的，因此这一古老的mex3a基因，作为空气呼吸基因，可能在治疗人类低氧相关疾病方面具有潜力。
研究局限
本研究旨在阐明古老的空气呼吸基因mex3a的功能及其调控机制，目标是将其作为培育耐低氧鱼类的候选基因，或助力解决人类低氧相关疾病。我们已在泥鳅中构建了mex3a敲除模型，并发现mex3a确实能够调控血管生成。理想情况下，构建泥鳅mex3a过表达模型将提供更多见解。然而，这一过程具有挑战性，耗时且成功率极低。尽管存在这些限制，我们在人脐静脉内皮细胞中构建的mex3a过表达模型也确认了该基因在促进血管生成中的作用。我们的研究结果将有助于未来深入理解鱼类空气呼吸机制，并为培育耐低氧鱼类品种提供有价值的资源。
Cite
The loach haplotype-resolved genome and the identification of Mex3a involved in fish air breathing
Sun, Bing et al. Cell Genomics, Volume 4, Issue 10, 100670
DOI: 10.1016/j.xgen.2024.100670
