本文为预印本文章，文章发表平台为Nature Springer旗下的Research Square预印本服务平台，稿件提交时间为2023年2月14日。目前仍显示处于审稿状态中。本文章是BAT 1K项目的阶段性成果。因本文未经同行评议，请谨慎看待文章的结果与结论。
上述蝙蝠图片来自BAT 1K项目官网
关于Bat1K
Bat1K是一个旨在对所有现存蝙蝠物种开展基因组测序的联盟，预计总共涵盖大约1400种蝙蝠。该联盟的主要目标是揭示蝙蝠的基因及其适应性背后的遗传机制，从蝙蝠基因组中挖掘其秘密。利用我们最新的基因工具，我们将对世界上每种蝙蝠的蓝图和遗传密码进行深度测序。测序第一个人类基因组花费了超过13年和30亿美元，鉴于该领域的重大进展，现在的测序速度更快，成本更低。我们必须将这些令人惊叹的技术进步充分利用，并推动其潜力的实现。想象一下，从蝙蝠基因组中揭示出更长寿命、飞行、回声定位和抗病能力的秘密。
这个项目的成功依赖于全球蝙蝠研究人员、志愿者、学生和蝙蝠爱好者的共同努力。通过发起这种动员，将蝙蝠研究人员、野外生物学家、基层保护组织和普通民众团结在一起，将使我们能够识别和定位所有蝙蝠物种，从而揭示它们的秘密。我们将形成一个活跃而充满活力的社区，成员们团结在一起，共同致力于保护、深入理解和推广蝙蝠。
BAT1k项目规划时间表
Bat1K将分为三个阶段进行：
第一阶段：从翼手目（Chiroptera）的21个科中选择代表物种，作为Bat1K的起点。
第二阶段：对剩余属的代表物种进行基因组测序。
第三阶段：对翼手目中的所有其他物种进行基因组测序。
摘要
蝙蝠携带的病毒可导致其他哺乳动物发生严重疾病。蝙蝠的无症状感染表明其组织损伤性炎症和免疫病理反应较为有限。为了研究蝙蝠抗病的基因组基础，Bat1K项目生成了十种蝙蝠物种的参考级基因组。一项系统性分析显示，蝙蝠免疫基因的选择信号比其他哺乳动物更为普遍。我们发现，翼手目祖先及其许多后代的蝙蝠谱系中，免疫基因适应性变化显著增加，特别是在病毒入侵和检测，以及抗病毒和炎症反应的调节因子中。ISG15 是一种抗病毒基因，在 COVID-19 期间与过度炎症（hyperinflammation）反应相关。研究发现，在菊头蝠和蹄蝠中，ISG15基因中负责形成同源二聚体的半胱氨酸发生了缺失。细胞感染实验表明，蝙蝠ISG15在细胞内的蛋白质共轭增强，且未分泌至细胞外空间，而在人类中，ISG15会在细胞外刺激炎症反应。我们的研究揭示了蝙蝠对病毒耐受性和抗病能力的分子机制。
背景介绍
蝙蝠被认为是多种病毒的天然宿主，其中一些病毒能够跨越物种屏障，导致人类和其他动物发生人畜共患疾病。目前，已经在蝙蝠体内发现了来自31个病毒科的病毒，包括副黏病毒（如亨德拉病毒、尼帕病毒、腮腺炎病毒）、丝状病毒（如马尔堡病毒、邦巴利埃博拉病毒）、弹状病毒（如狂犬病毒）和冠状病毒。在冠状病毒中，MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2等乙型冠状病毒的近缘病毒也在蝙蝠中被发现。这些病毒可在人类中引发疾病，如COVID-19，导致发热、咳嗽、肺炎、急性呼吸窘迫，有时甚至会有致命的危险。尽管MERS-CoV和SARS-CoV传入人类可能通过了哺乳动物中间宿主（如果子狸、骆驼），但累积的数据表明，这三种冠状病毒都起源于蝙蝠，其中亚洲马蹄蝠（菊头蝠科）可能是SARS-CoV和SARS-CoV-2的祖先来源，而埃及墓蝠（鞘尾蝠科）可能是MERS-CoV的祖先来源。
冠状病毒在蝙蝠中分布尤为广泛，已在21个蝙蝠科中的15个科的物种中被检测到。一项对非洲、拉丁美洲和亚洲国家超过19,000只哺乳动物个体的调查发现，8.6%的蝙蝠个体携带冠状病毒，而非蝙蝠个体的冠状病毒携带率仅为0.2%。研究还表明，蝙蝠物种的多样性与冠状病毒的多样性密切相关。同样，宏基因组筛查显示，啮齿动物中检测到的病毒中有1.4%是冠状病毒，而蝙蝠中检测到的病毒中有17.8%属于冠状病毒科（图1A，补充表1）。特别要说明的是，在已检测的蝙蝠科中，冠状病毒在马蹄蝠（菊头蝠科）和圆叶蝠（蹄蝠科）中更频繁被发现（图1B）。
图1 10份高质量的染色体水平的蝙蝠参考基因组
尽管冠状病毒和其他人畜共患病毒能在人类和其他哺乳动物中引发严重疾病甚至死亡，但这些病毒在其天然宿主蝙蝠中通常表现为无症状感染。事实上，将蝙蝠实验性地接种冠状病毒或马尔堡病毒后，尽管出现了有效的病毒感染和复制过程，但未见明显的临床疾病症状。这表明，蝙蝠对病毒具有更高的耐受性，并且它们进化出了一种独特的免疫反应，能够平衡抗病毒与抗病能力。蝙蝠对病毒感染的抗病策略之一是清除体内病毒，同时控制感染引发的炎症，避免细胞毒性和组织损伤。先前的研究表明，蝙蝠能够激活有效的抗病毒反应，但会限制炎症细胞因子的表达，抑制失控的免疫反应，从而减少免疫性病理损伤。例如，感染马尔堡病毒的埃及果蝠（Rousettus aegyptiacus）会上调抗病毒基因的表达，如IRF7、RIG-I、ISG15、MX1、IFIT1/2/3和STAT1，但不会强烈地诱导促炎基因的表达。
基因组分析揭示了蝙蝠免疫系统变化的机制，这些变化可能有助于增强蝙蝠对病毒的抵抗力，例如病毒入侵因子和先天免疫反应基因的选择性进化，自然杀伤细胞受体的激活和抑制机制多样化，调控经典NF-κB信号的促炎基因的选择性丢失，I型干扰素基因的扩张和收缩，以及激活炎症小体的PHYIN基因的缺失。进一步的研究表明，蝙蝠对多种免疫刺激表现出炎症小体系统的整体减弱。由于飞行需要很高的代谢率，而快速代谢和细胞压力的副产物常常会激活免疫系统，因此更强的病毒耐受性可能是蝙蝠免疫系统适应飞行引发的无菌性炎症的副产物。然而，蝙蝠病毒耐受性背后的分子机制尚未完全揭示。
为了阐明蝙蝠抗病能力的基因组基础，我们组装了十种蝙蝠物种的参考级基因组。我们选择了四种菊头蝠（R. yonghoiseni、R. lanosus、R. affinis、R. trifoliatus）和三种蹄蝠（H. larvatus、Aselliscus stoliczkanus、Doryrhina cyclops），主要来自东南亚。这些物种代表了这些科内的不同分支。已知其中一些物种携带冠状病毒，且东南亚的菊头蝠被认为是SARS-CoV和SARS-CoV-2祖先的天然宿主。为了涵盖姐妹科——鼠尾蝠科（Rhinopomatidae）和假吸血蝠科（Megadermatidae）的代表物种，我们对大鼠尾蝠（Rhinopoma microphyllum）和马来假吸血蝠（Megaderma spasma）进行了测序。最后，我们对安哥拉犬吻蝠(Mops condylurus)（犬吻蝠科）进行了测序，该物种被认为是天然邦巴利埃博拉病毒的宿主。一项对115个哺乳动物基因组的系统性分析显示，蝙蝠免疫基因中适应性进化的痕迹最为显著，提供了该哺乳动物目免疫系统特殊适应性的基因组证据。我们的筛查发现，蝙蝠的抗病毒效应基因和炎症免疫反应的调节因子发生了变化，可能与人类疾病相关。通过对ISG15的比较实验，该抗病毒因子在菊头蝠和蹄蝠中表现出关键的半胱氨酸缺失，揭示了人类和蝙蝠在ISG15细胞外促炎功能上的根本差异。总之，我们的研究为蝙蝠抵抗病毒的基因组机制提供了新的见解，并揭示了蝙蝠ISG15功能变化与感染引发炎症减缓之间的联系。
结果
十份新的参考级染色体水平的蝙蝠基因组
我们使用长读长和长距离测序技术，进行了高度连续且完整的参考基因组组装，符合Bat1K项目的标准。我们从博物馆藏样本中获取了10种蝙蝠中8种的遗传材料（补充表2），这凸显了博物馆藏在生物多样性基因组学中的重要性。我们对其中9个物种进行了27-42 ×的PacBio CCS（HiFi）测序，提供了用于构建contig的长且准确的reads数据，并使用~60 ×覆盖的染色体构象捕获（Hi-C）Illumina reads数据进行scaffolding。马来假吸血蝠（Megaderma spasma）基因组是基于一份25年前的组织样本来组装的，使用了81 ×覆盖的Oxford Nanopore long reads数据、Bionano光学图谱、Hi-C数据，以及10X Genomics Illumina short reads数据用于纠正碱基错误。
这10个基因组组装均远超Bat1K的最低标准。其中5个新基因组的连续性优于现有的最佳蝙蝠基因组组装，其contig N50值在12.5-72.2 Mb之间（图1C，补充图1-2）。contig N90值在3.8-32.6 Mb之间，表明至少90%的基因组组装被包含在跨越数Mb的连续序列中。此外，91.8%-99.7%的基因组被包含在染色体水平的scaffolds中，scaffold N90在45.4-137.8 Mb之间（图1D，补充图3）。与之前基于HiFi的蝙蝠基因组组装结果一致，我们估计9个基于HiFi的组装具有非常高的碱基准确度（QV=61.8-69.7，表示每Mb错误率低于1）。这些碱基准确度比之前基于PacBio CLR或Nanopore的组装高出两个数量级。接着，我们比较了每个基因组组装中推断出的18,430个祖先有胎盘哺乳动物的编码基因的状态，使用的是TOGA（基于基因组比对推断直系同源基因的工具），该方法整合了比较基因注释、推断直系同源基因及基因分类。与短reads组装相比，新的和之前基于长reads的组装一致地表现出更多的完整开放阅读框的基因，且无因组装不完整或片段化而导致的缺失序列（图1E，补充图4，补充表3）。这支持了基因组组装的高度完整性和质量，这也是全面注释转座元件的前提条件。与典型哺乳动物相比，新测序的蝙蝠基因组显示出近期的DNA转座子插入的积累，这与其他蝙蝠的观察结果相似（补充图5）。
为了进行比较分析，我们将新组装的基因组数据置于蝙蝠系统发育框架中。通过多物种溯组法和16,860个1:1直系同源基因（代表30,354,372 bp）的串联比对，我们始终推断出相同的系统树拓扑结构（图1F），与之前基于更少数据推断的系统发育结果一致。所有节点的支持值都很高。最后，我们使用了一种惩罚似然方法，并结合17个化石校准点，推断出带有时间的校准树（图1F，补充图6，补充表4），估计菊头蝠科与蹄蝠科的分化大约发生在3500万年前。
免疫基因的选择作用在蝙蝠中最为显著
蝙蝠在病毒感染时能够抵御疾病的能力，可能是宿主与病毒长期共同进化的结果，这一过程造就了免疫系统的适应性改变。其中一些适应性变化可能表现出基因正选择的标记。因此，我们设计了一种全基因组筛查方法，测试在不同哺乳动物目和不同功能基因组中，正选择的普遍性。为此，我们首先使用TOGA对从新测序和之前测序的蝙蝠基因组（共20个物种）以及代表10个哺乳动物目的95个非蝙蝠物种中获得直系同源基因（图2A，补充表5）。在基因组可用的情况下，我们在每个目中选择了最多20个物种，选择了至少包含16,000个完整直系同源基因的基因组（补充图7）。然后，我们使用敏感的分支位点模型aBSREL，测试115个物种的系统树中每条分支上的正选择。与测试中预先定义的假设不同，这种方法允许进行探索性筛查，因为基因的选择可以在多条独立的分支上发生，并且可能检测到重复或趋同的选择模式。在所分析的17,130个基因中，我们发现其中8,608个基因在115个物种的系统树中的228条分支中的至少一条分支上显示出了选择信号（补充表6）。
图2 免疫相关基因的选择作用在蝙蝠中很普遍
对所研究的10个哺乳动物目，我们开展了受选择作用的基因的功能富集分析。考虑所有高级别的生物过程，基于Gene Ontology（GO）顶级术语的定义，我们发现蝙蝠在“免疫系统过程”方面的富集最强，其次是啮齿动物（也已知携带多种病毒的哺乳动物目）和非洲兽类（图2A，补充图8，补充表7）。这一模式并非由分类学代表的不均衡或基因组质量的显著差异所驱动，因为其他四个哺乳动物目（灵长目、啮齿目、鲸偶蹄目、食肉目）同样由20个物种组成，并且具有相当的基因组组装质量（补充图7）。此外，将筛选应用于四个子样本，通过随机选择蝙蝠、灵长目、啮齿目、鲸偶蹄目和食肉目中的10个物种，稳健地检测到蝙蝠的“免疫系统过程”富集信号最强（补充图9），验证了这一结果不是由少数几种蝙蝠物种驱动，而是代表了整个蝙蝠目的普遍情况。
我们观察到，无论是在中性区域还是编码区域，以百万年和每个位点替换数度量的分支长度与选择的免疫基因数量显著相关（图2B，补充图10）。与之前在少数物种上的模拟结果一致，这可能反映了在较长时期内较高频率地发生正选择，以及在较长分支上检测能力的增强。因此，我们使用回归模型计算了每条分支上预期选择的“免疫系统过程”基因数量（补充表8和9）。通过标记观察到的免疫基因与预期值的差异，我们发现许多蝙蝠谱系和物种是异常值，表明蝙蝠目中的免疫相关选择高于预期（图2C）。此外，拟合两个截距的模型（一个针对蝙蝠，另一个针对其余哺乳动物）显示，蝙蝠的截距明显更高，这与蝙蝠中存在更多的免疫基因选择一致（补充图11）。值得注意的是，蝙蝠祖先分支有42个观察到免疫相关基因，而预期值为21个，这一相对数量大于其他所有目的祖先分支（例如非洲兽类中观察到42个，预期为24个，啮齿类中观察到20个，预期为21个）（图2C，补充表8）。类似的模式也在“免疫反应”这一单独的GO术语，以及WikiPathways的“SARS-CoV-2网络图”和“SARS-CoV-2先天免疫逃逸与细胞特异性免疫反应”中观察到（补充图12-15）。这些结果表明，免疫系统的变化早在蝙蝠目进化出飞行能力时就已出现。
接下来，我们分析了“免疫系统过程”的子术语在115种哺乳动物中的情况，结果显示，与其他哺乳动物目相比，蝙蝠中受选择的基因最常富集于“免疫反应”（这也有助于图2C中显示的高水平过程“对刺激的反应”的富集），“免疫系统过程的调节”，“免疫效应过程”和“白细胞激活”（图2D）。这些类别在我们的子样本分析中也稳健地表现出蝙蝠目中最强的富集（补充图16）。更具体的GO术语进一步突出了蝙蝠目在先天和适应性免疫系统相关方面的富集特征（图2E）。
蝙蝠中与免疫相关的关键变化
与人类不同，在严重情况下SARS-CoV-2、MERS-CoV和其他冠状病毒感染可能会引发严重的炎症反应、呼吸功能不全和多器官衰竭，然而菊头蝠、蹄蝠及其他蝙蝠感染后似乎表现为无症状，这一表型也在某些蝙蝠物种的感染MERS-CoV或SARS-CoV-2实验中观察到。为了深入了解可能参与蝙蝠抵御病毒的基因，我们结合了有关冠状病毒及其他病毒免疫反应的基因信息与正选择基因，重点研究了在蝙蝠祖先分支（C）、菊头蝠和蹄蝠共同的祖先分支以及菊头蝠祖先分支（R）的选择情况。结果显示，这些基因与病毒入侵和检测、炎症调控、抗病毒机制、补体系统激活以及B细胞信号传导有关。
图3 受选择基因参与了病毒感染期间的免疫响应反应
冠状病毒通过宿主细胞表面受体入侵宿主细胞。这些受体常常成为宿主与病毒竞争的对象。类似于SARS-CoV-1/2的受体ACE2，我们在菊头蝠中发现了ANPEP基因（在R分支中被选择），该基因编码了人冠状病毒229E的受体。此外，SCARB1（在RH分支中被选择）是一种辅助因子，能够通过增强细胞表面结合来促进SARS-CoV-2的入侵。还有溶酶体蛋白酶CTSB（在C和R分支中被选择），它介导了埃博拉病毒和呼肠孤病毒的入侵。
病毒感染通过模式识别受体（PRRs）被检测到，包括类 Toll 受体（TLRs）和 RIG-I 类受体（RLRs），这些受体诱导先天免疫反应并释放促炎细胞因子。炎症过程对于控制病原体以及恢复组织稳态至关重要，但需要严格调控以限制非特异性免疫介导的组织损伤，重症COVID-19就是一个例子，超级炎症反应可能导致肺组织损伤。我们发现几种在蝙蝠中受到选择的基因参与了病原相关分子模式的检测和炎性免疫反应的调节。TLR8（在RH和R中重复选择）在检测内吞病毒（如 SARS-CoV-2）的单链 RNA 后诱导促炎细胞因子的产生。TRIM38（在R中选择）编码一种干扰素诱导的酶，具有E3泛素和SUMO连接酶活性，在免疫中发挥多种作用。在早期感染期间，TRIM38通过对病毒 RNA 传感器 RIG-I 和 MDA5 以及病毒 DNA 感受器 cGAS 和 STING 进行 SUMO化，从而防止它们的降解，增强对 RNA 和 DNA 病毒的先天免疫反应。在晚期感染中，TRIM38受到干扰素的上调，并以多种方式抑制炎症反应。通过促进 TLR3/4 适配蛋白 TRIF 的降解，TRIM38 抑制经典 NF-κB 和 IRF3 的激活。通过促进 TNF-α 和 IL-1β 信号通路中 TAB2/3 的降解，TRIM38 进一步抑制 NF-κB 的激活和促炎细胞因子的产生。因此，TRIM38 在早期介导强烈的先天免疫反应，并有助于在后期抑制炎症，这些过程在蝙蝠中更加显著。BTK（在C组中选择）编码一种细胞内酪氨酸激酶，在适应性（下文）和先天免疫中发挥多种作用。通过与 TLR 信号通路的多个组分相互作用，例如 TLR4/6/8/9、适配器蛋白 MyD88 和激酶 IRAK1，BTK 有助于 TLR 诱导的抗炎细胞因子 IL-10 的产生。通过与 NLRP3 炎症小体组分相互作用，BTK 对炎症小体的激活至关重要。在重症COVID-19患者中，BTK抑制剂可以减少超炎症反应。TNFAIP2（在RH中选择）是一种TNFα诱导的基因，参与NF-κB信号的负反馈调节。HP（结合蛋白；在C和RH中重复选择）是一种具有免疫调节功能的急性相蛋白，抑制T细胞增殖以及从各种免疫细胞类型中分泌促炎细胞因子（白细胞介素、TNF-α）。此外，HP可以直接结合TLR4并激活TLR4信号，这刺激IFN-β（由IFNB1编码，在C中选择）的分泌。最后，我们发现IL36A是一种促炎白细胞介素，属于IL-1超家族，刺激NF-κB信号，在菊头蝠科（Rhinolophidae）、蹄蝠科(Hipposideridae)、假吸血蝠科（Megadermatidae）和鼠尾蝠科(Rhinopomatidae)的共同祖先中丧失（补充图18A）。另一个促炎IL36家族成员IL36G在蝙蝠祖先中丧失，但在所有调查的蹄蝠中，该基因保留了完整的阅读框（补充图18B-D）。
I型干扰素（IFN-I）反应在适应性免疫系统激活之前对抗病毒感染。虽然延迟或无效的IFN反应与严重COVID-19相关，但在感染后需要下调IFN，因为持续的IFN产生会导致免疫病理，并且是自身免疫疾病的一个标志（图3D）。我们发现不仅在IFNB1上存在选择，还发现其他几种调节或受IFN信号调节的基因。IFNB1通过抑制IL17产生T辅助细胞的分化来抑制IL17A（在C组中被选择）的分泌，IL17A是一种强效的促炎细胞因子，参与引发重症COVID-19中的细胞因子风暴。值得注意的是，SARS-CoV-2编码的分泌糖蛋白ORF8可以模拟IL17A，并能够结合IL17受体以诱导促炎因子的产生。IFNB1和其他I型干扰素激活JAK-STAT级联反应，诱导干扰素刺激基因，如IFIT2（也称为ISG54）、IFIT3（ISG60）和ISG15。IFIT2（在C组中被选择）和IFIT3（在R组中被选择）编码细胞质蛋白，这些蛋白通过感应病毒mRNA并抑制其翻译，从而限制冠状病毒和其他许多病毒的复制。ISG15是一种抗病毒蛋白，但在蝙蝠的ISG15中缺少一个关键的半胱氨酸残基，该残基对形成同源二聚体是必需的（详细调查如下）。其他与IFN调节精细调节相关的基因包括LRRC25（在C组中受到选择），该基因参与负反馈回路，避免通过促进细胞质dsRNA传感器RIG-I的自噬降解而导致的持续免疫激活。具体来说，在病毒感染后，LRRC25以依赖ISG15的方式结合RIG-I，促进RIG-I降解，从而负向调节RIG-I介导的IFN-β和IFN-I诱导基因（如IFIT1/2）的表达。以类似的方式，当位于细胞内时，NMI（N-myc和STAT相互作用因子；在RH组中受到选择）通过促进转录因子IRF7的蛋白酶体降解来抑制IFN-I和IFN刺激基因（如IFIT1/3和ISG15）的表达，IRF7在感染晚期对IFN-I的诱导非常重要。相反，由活化的巨噬细胞释放的细胞外NMI通过结合TLR4并激活经典NF-κB，诱导释放促炎细胞因子（如TNF和IL-6）。因此，根据其位置，NMI具有抗炎或促炎的作用。
补体系统帮助吞噬或裂解病原体，刺激适应性免疫反应并促进炎症。然而，在COVID-19期间，过度的补体激活可能导致超级炎症和血栓形成。我们检测到了两个补体成分，C7和C1S，这两个成分在RH组中均受到选择。C1S编码一种丝氨酸蛋白酶，参与经典途径的早期激活级联反应。C7是膜攻击复合物的一个组成部分，形成膜破坏孔，并在被内吞后激活非经典的NF-κB信号通路和炎症小体组装（图3F）。
最后，两个被选择的基因，CD79A（在RH组中被选择）和上述的酪氨酸激酶BTK，是B细胞信号传导的关键因子。CD79A是B细胞抗原受体的信号转导亚基，在磷酸化后介导BTK的磷酸化。激活的BTK通过Akt、NF-κB和其他信号通路促进B细胞受体介导的B细胞存活（图3E）。综上所述，多种与病毒入侵、先天免疫反应调控、补体激活和B细胞存活相关的基因在蝙蝠中受到了选择，有望成为未来研究的靶基因。
菊头蝠科和蹄蝠科蝙蝠的ISG15在抗病毒活性上存在差异
ISG15是一种抗病毒的类泛素蛋白，受干扰素（IFN）强烈诱导，在COVID-19期间的超级炎症反应中起重要作用。ISG15可以与数百种新合成的宿主和病毒蛋白结合（这一过程称为ISG化——ISGylation），而这一过程会受到病毒免疫逃逸蛋白的抑制。例如，ISG化对于IRF3和MDA5介导的抗病毒反应是必要的，而SARS-CoV-2编码的木瓜蛋白酶（PLpro）通过去ISG化IRF3和MDA来抑制这些反应。有趣的是，HERC5编码基因介导ISG15结合的蛋白连接酶，在R. trifoliatus、R. lanosus和R. sinicus的共同祖先中受到了正选择（补充表6）。除了细胞内的依赖结合的作用外，自由形式的ISG15还可以分泌到细胞外，在那里它作为细胞因子促进促炎性细胞因子和趋化因子的分泌。SARS-CoV-2 PLpro的去ISG化活性增加了自由ISG15的pool，导致ISG15分泌增加，并增强了促炎因子的产生，这与COVID-19患者的免疫病理学表现一致。
我们发现，在所有菊头蝠科和蹄蝠科蝙蝠的ISG15中，一个高度保守的半胱氨酸残基（人类ISG15中的Cys78）都发生了缺失（图4A）。重要的是，该半胱氨酸残基对于形成稳定的ISG15同源二聚体及其细胞因子功能正常发挥至关重要。此外，突变Cys78会增强ISG化，可能是因为二聚化的ISG15无法用于ISG化。为了确认Cys78的缺失是否也阻止了蝙蝠ISG15形成稳定的同源二聚体，我们进行了结构建模。为此，我们使用AlphaFold2推断了Rhinolophus sinicus、Doryrhina cyclops和人类ISG15的假设的同源二聚体的三维结构，并进行了总时长为3微秒（约550,000 CPU核时）的分子动力学模拟。虽然含有Cys78的人类ISG15二聚体在模拟过程中确实保持稳定，但缺乏Cys78的蝙蝠二聚体显得更加不稳定，因为它采用了与初始AlphaFold2结构明显不同的多种拓扑构象（补充图19-22）。鉴于Cys78对于ISG15功能的重要性以及ISG15在COVID-19期间超级炎症反应中的作用，我们进一步研究了蝙蝠和人类ISG15之间的功能差异。
图4 蝙蝠ISG15抗病毒能力的变化
为了探索蝙蝠ISG15在对抗病毒尤其是冠状病毒方面的抗病毒能力是否发生了改变，我们合成了来自六种菊头蝠科（Rhinolophus affinis、R. lanosus、R. yonghoiseni、R. sinicus、R. trifoliatus、R. ferrumequinum）、三种蹄蝠科蝙蝠（Aselliscus stoliczkanus、H. larvatus、Doryrhina cyclops）和人类的ISG15，并比较了它们对四种不同病毒（泡疹性口炎病毒、甲型流感病毒、人类冠状病毒229E和SARS-CoV-2）的抗病毒能力。首先，我们瞬时转染了HEK293（人类永生化胚胎肾）细胞，并用带有GFP标记的泡疹性口炎病毒（VSV，一种在蝙蝠中常见的弹状病毒科病毒）感染这些细胞。FACS分析显示，除了R. trifoliatus 的ISG15（图4B，补充表10），所有ISG15蛋白都表现出了明显的抗病毒能力。值得注意的是，几种蝙蝠（R. lanosus、R. yonghoiseni和R. trifoliatus，均属于同一谱系）在阻止VSV感染方面的效率明显低于人类ISG15，揭示了蝙蝠ISG15功能的物种差异。受感染的HEK293细胞中的病毒载荷通过GFP强度来衡量，所有物种相对于空载体对照组均有所降低，但测试的物种之间没有显著差异（补充图23，补充表11）。
有趣的是，我们注意到未感染的ISG15表达细胞有时生长更快。为验证这一点，我们在未感染的稳定转染了人类或九种蝙蝠ISG15的HEK293细胞中测量了细胞生长和ATP周转率（补充图24-25，补充表12-13）。的确，与人类ISG15或空载体对照相比，六种蝙蝠未感染的HEK293细胞显示出明显的生长增加。这表明某些蝙蝠的ISG15可能在抗病毒防御之外具有其他功能，这可能与一些蝙蝠表现出持续的ISG15表达有关。
接下来，我们检测了ISG15对甲型流感病毒（IAV）的抗病毒能力，甲型流感病毒是常见于蝙蝠的正粘病毒科病毒。我们稳定转染了A549（人类肺腺癌细胞）细胞，并用甲型流感病毒（H1N1/PR8株）直接感染每个转染品系，并进行了斑点测定实验（图4C，补充图26，补充表14）。虽然人类ISG15对IAV具有抗病毒效力，证实了之前的研究结果，但其抗病毒效果明显低于六种菊头蝠中的五种。只有R. sinicus ISG15没有明显的抗病毒活性。在三种蹄蝠中，只有A. stoliczkanus的ISG15具有抗病毒能力。与人类ISG15相比，IAV感染的A549细胞中，表达蝙蝠ISG15的通常表现出更高水平的MX1，这是已知的IAV抗病毒限制因子，而在没有ISG15的感染细胞中未检测到MX1（补充图27）
为了比较ISG15对冠状病毒的抗病毒活性，我们生成了稳定表达人类冠状病毒（HCoV）229E受体ANPEP（CD13）的HEK293细胞，并感染了它们与蝙蝠/人类的ISG15构建体。虽然人类ISG15表现出明显的抗病毒效果，但在蝙蝠中，只有R. ferrumequinum的ISG15具有显著的抗病毒效果（图4D，补充表15）。一致的是，通过病毒N蛋白染色测量的病毒负荷也在表达R. ferrumequinum和人类ISG15的感染细胞中大幅减少（补充图28，补充表16）。相比之下，R. sinicus ISG15增加了感染细胞内的N蛋白含量，表明病毒复制增加。是否与感染性颗粒的释放增加相关还有待确定。
最后，我们测试了ISG15对SARS-CoV-2感染的影响。稳定表达SARS-CoV-2受体ACE2的A549细胞被转染了蝙蝠/人类的ISG15构建体，并感染了SARS-CoV-2。与空载体对照相比，虽然人类ISG15未能减少SARS-CoV-2的产生，但九种蝙蝠中有五种的ISG15显著减少了病毒释放，通过TCID50实验进行测量（图4E，补充表17）。
与具有Cys78残基的人类ISG15相比，缺乏Cys78的菊头蝠和蹄蝠科蝙蝠的ISG15在我们的实验中并未显示出一致的抗病毒差异。因此，我们通过突变人类ISG15中的Cys78并恢复R. affinis ISG15中的半胱氨酸来直接研究这一半胱氨酸。在HCoV-229E中，突变Cys78或恢复该半胱氨酸导致的抗病毒差异虽然较小，但仍显著（图4F，补充表15）。此外，突变人类ISG15中的Cys78赋予了显著降低SARS-CoV-2病毒产生的能力（图4G）。恢复R. affinis ISG15中的该半胱氨酸则维持了显著的抗SARS-CoV-2活性（图4G，补充表17）。
总之，我们的实验表明，菊头蝠科和蹄蝠科的ISG15在很大程度上保留了其抗病毒效应，但在物种和病毒方面存在未能通过共同的Cys78缺失解释的差异，表明个别蝙蝠中的其他突变（图4A）也影响了ISG15的抗病毒活性。进一步研究ISG15的物种特异性效应可能会为人类ISG15的抗病毒能力和功能提供更多见解。
ISG15 在蝙蝠（如菊头蝠科和蹄蝠科）细胞内保持内源性状态，并显示出增强的ISGylation
Cys78 是 ISG15 同源二聚体形成及其细胞外细胞因子发挥正常功能所必需的。因此，我们在 HCoV-229E 感染的细胞的上清液中测量 ISG15，以比较存在于细胞外空间的游离 ISG15 水平。与人类 ISG15 可在细胞外易于检测不同，所有测试的菊头蝠科和蹄蝠科的细胞外 ISG15 几乎无法检测到（见图 4H，补充图 29-34，补充表 18）。在细胞内，所有测试的蝙蝠的游离 ISG15 水平降低，而与蛋白质结合的 ISG15 水平增加，这与人类 ISG15 的情况相反。意外的是，人类 ISG15 中 Cys78 的突变并未显著减少其分泌到细胞外空间（见图 4H）。然而，突变人类 Cys78，特别是突变为丝氨酸，导致细胞内游离 ISG15 降低，而 ISG15 的结合水平增加（见图 4H）。在 R. affinis ISG15 中恢复 Cys78 则增加了其分泌到细胞外的能力。综合来看，这表明 ISG15 的细胞外促炎功能依赖于 Cys78，在菊头蝠科和蹄蝠科中影响最小。
讨论
为阐明蝙蝠在病毒抗性方面的基因组基础，我们对十个新的参考级蝙蝠进行了基因组测序，重点关注携带多种人畜共患冠状病毒的菊头蝠科（Rhinolophidae）和蹄蝠科(Hipposideridae)。我们发现基于 PacBio HiFi reads的蝙蝠基因组组装通常具有更优的连续性和碱基准确性，这与脊椎动物基因组计划、达尔文生命之树和地球生物基因组计划的结果一致，并支持“HiFi+HiC”数据的组合是生成蝙蝠参考级质量基因组的有效策略。
我们的探索性选择筛查发现，许多哺乳动物目在免疫相关基因上显示出显著富集的选择信号，这与病原体施加的选择压力促进免疫基因的快速进化是一致的。然而，与其他哺乳动物目相比，蝙蝠在免疫基因选择方面表现出最强的富集信号，提供了蝙蝠独特免疫系统适应性的基因组证据。使用我们综合的数据集，包括115种哺乳动物和228个系统发育分支，我们观察到分支长度与受选择基因的数量显著相关。回归模型用于估计预期的选择基因数量，显示出翼手目祖先分支在免疫基因选择方面超出预期。这支持了飞行进化与免疫系统适应性之间的联系；然而，仍需确定飞行与免疫系统变化之间是否存在直接或间接的联系。虽然我们将回归模型专门应用于免疫基因，但这种方法是揭示具有特定功能类别基因过度选择谱系（分支）的普遍策略。
在翼手目祖先或菊头蝠科/蹄蝠科谱系中受正选择的免疫基因涉及病毒入侵、病毒检测以及先天性免疫、适应性免疫和补体系统的抗病毒反应过程。此外，几个受选择的基因通过抑制促炎细胞因子的产生和参与干扰素信号的负反馈控制，调节炎症反应，表明这些基因可能有助于防止蝙蝠在病毒感染期间的炎症反应的失控。总体而言，我们的研究结果为实验分析提供了有富有前景的靶标基因，并为揭示蝙蝠免疫系统独特适应性的秘密提供了见解。
ISG15 是其中一个靶标基因，并且其显示出一个显著差异（Cys78 缺失），这一特征在菊头蝠科和蹄蝠科中共有。我们的实验揭示了人类与蝙蝠之间抗病毒效能的差异，以及不同蝙蝠间 ISG15 的差异，这可能与 ISGylation 目标蛋白的种类有关。尽管 Cys78 缺失与菊头蝠科/蹄蝠科 ISG15 的一致的病毒限制模式无关，表明其他残基的突变也会调节 ISG15 功能，但值得注意的是，突变 Cys78 赋予人类 ISG15 抑制 SARS-CoV-2 的能力。与 Cys78 为同源二聚体形成的关键及 ISG15 作为细胞外细胞因子的角色一致，我们发现人类 ISG15 被分泌到细胞外。相反，蝙蝠 ISG15 不被分泌，但显示出增强的细胞内 ISGylation。此外，通过突变人类 ISG15 中的 Cys78 或在 R. affinis 蛋白中恢复该位点，分泌和 ISGylation 可以部分改变。尽管仍需进一步实验，但这些发现表明 Cys78 的缺失（与蝙蝠中的其他突变一起）可能对 ISG15 功能产生两个影响。首先，Cys78 的缺失可能通过防止二聚体形成并增强 ISGylation，抵消病毒逃逸蛋白（如 SARS-CoV-2 PLpro）对去 ISGylation 的活性，这可能有助于维持 ISG15 的细胞内抗病毒活性。其次，Cys78 的缺失可能通过减少 ISG15 的细胞外促炎功能，从而降低其在细胞外的作用。因此，ISG15 可能是菊头蝠科和蹄蝠科能够产生有效抗病毒反应而不引发过度炎症的因素之一。
为了全面阐明蝙蝠的宿主-病毒共同进化历史，需要涵盖蝙蝠各科多样性的参考级基因组；正在进行的 Bat1K 联盟第一阶段将很快提供这些数据。参考基因组、单细胞转录组图谱、它们的免疫系统、繁殖群体、蝙蝠细胞系、类器官及生成诱导多能干细胞的能力，为阐明使蝙蝠能够容忍病毒且不表现症状的分子适应性机制提供了新工具。总之，这使蝙蝠成为比较哺乳动物生物学的新兴模型系统，不仅提供了对特殊免疫系统适应性的见解，还提供了关于健康衰老、增强疾病抵抗力以及其他突出的翼手目特征的见解。
Cite
Ariadna Morales, Yue Dong, Thomas Brown et al. Reference-quality bat genomes illuminate adaptations to viral tolerance and disease resistance, 14 February 2023, PREPRINT (Version 1) available at Research Square [https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-2557682/v1]
