文献分享|JAFC：探索新型生物合成途径和重调控前体合成途径发酵生产麦角硫因（EGT)
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2024-12-09 09:19
浙江
Fermentative Production of Ergothioneine by Exploring Novel Biosynthetic Pathway and Remodulating Precursor Synthesis Pathways期刊：《Journal of Agricultural and Food Chemistry》 IF：5.6DOI：10.1021/acs.jafc.4c03348麦角硫因（EGT）是一种天然的组氨酸衍生物，具有无毒、安全和稳定的特点，被广泛应用于医药、化妆品和食品工业。然而，由于生物合成途径的局限性、前体代谢网络的复杂性以及发酵成本高，EGT的可持续生产面临挑战。EGT在人体内无法自行合成，需通过有机阳离子转运蛋白（OCTN1）从外部获取。EGT具备多种益处，包括抗氧化、抗炎、神经保护和改善疾病状况，且已被欧盟批准为新型食品成分，可用于膳食补充剂。目前，EGT的市场价值预计将在2027年达到5.25亿美元，推动了对其合成途径和生理功能的深入研究。现有的EGT生产方法主要有提取、化学合成和生物合成，其中生物合成因其环保、经济、效率高且易于获取原料而备受关注。研究人员首先从水生红菌（Methylobacterium aquaticum）中分离出相关基因并构建了EGT的生物合成途径，并将该途径引入大肠杆菌（Escherichia coli）进行表达。此路径涉及三个关键酶：MaegtB、MaegtD和MaegtE，分别负责EGT生物合成中的关键反应步骤。研究人员通过调整质粒的拷贝数（质粒的数量和基因表达水平）来优化此途径，进而提高了EGT的产量。实验结果表明，EGT的产量从最初的29.5mg/L提高至35mg/L，增加了18.6%。质粒拷贝数优化显著提升了酶的表达效率，使大肠杆菌能够有效合成EGT。图1：EGT生物合成途径的设计与优化。（a）来自水生红菌DSM16371的EGT生物合成途径；（b）ECE1菌株中EGT产量与OD600随时间变化的趋势；（c）用于拷贝数优化的质粒构建示意图；（d）携带不同拷贝数的质粒菌株的EGT产量和OD600值比较。为进一步提高EGT的产量，研究团队对EGT前体氨基酸（组氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸）的代谢合成途径进行了系统的代谢工程改造。首先，敲除了负责抑制甲硫氨酸合成的转录抑制因子metJ基因，进而增强了甲硫氨酸的合成能力。此外，研究人员通过引入抗反馈抑制的突变基因metAmut和thrA以增加甲硫氨酸和组氨酸的供应。这些突变体分别提高了相关酶的活性，成功增加了前体氨基酸的产量。尤其是将serAmut1和thrA基因共同表达后，EGT的产量达到了120 mg/L。此外，敲除丝氨酸降解基因sdaA可以进一步提高胞内丝氨酸的积累，从而促进半胱氨酸的合成，使EGT产量提高至130 mg/L。图2：前体氨基酸的代谢工程改造以提升EGT产量。（a）metJ基因敲除对EGT产量的影响；（b）基因过表达和共表达对EGT产量的影响；（c）sdaA基因敲除对EGT产量的影响；（d）增加前体氨基酸供应对EGT产量的影响。在改良代谢途径的基础上，研究团队优化了发酵过程中的培养基组成。通过实验发现，20 g/L的葡萄糖浓度是最佳的碳源浓度。为了进一步降低生产成本，研究者将培养基中的酵母提取物（YE）替换为更为经济的玉米浆（CSL），这是一种玉米湿磨工艺的副产物，富含营养且成本低廉。玉米浆的最佳浓度为0.5%，在此浓度下的EGT产量与使用酵母提取物相比略有提高。在10L生物反应器中进行补料分批发酵实验，发酵周期为72小时，EGT的最终产量达到了595 mg/L，生产率为8.2 mg/L/h。这一结果表明，通过使用玉米浆等低成本原料，能够有效降低EGT生产的成本，同时保持较高的生产效率。图3：菌株ECE14的发酵过程优化。（a）在不同浓度的葡萄糖下产生的EGT浓度；（b）不同浓度的玉米浆（CSL）替代酵母提取物（YE）的效果评估。图4：ECE14 菌株在 10 L 生物反应器中的补料分批发酵曲线。这篇文章探讨了通过新颖的生物合成途径和代谢前体合成途径的改造来发酵生产麦角硫因（EGT）。研究首先在大肠杆菌中重构了从水生红菌（Methylobacterium aquaticum）提取的EGT合成途径，并通过质粒拷贝数的优化提高了产量。随后，通过代谢工程提高了前体氨基酸的供应，具体方法包括改造全局调节因子、引入耐反馈抑制的突变体、以及阻断竞争性代谢途径。最终，该研究使用玉米浸提液替代酵母提取物，开发了一种经济的培养基，并在10L的生物反应器中通过补料分批发酵，使EGT产量达到了595 mg/L。这项研究为EGT的高效低成本发酵生产奠定了基础。
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