8月，中国医师协会医学遗传医师分会、中华医学会儿科学分会罕见病学组等在《中华医学遗传学杂志》上发表了《肌营养不良蛋白病遗传学诊断专家共识》，从遗传学诊断角度，针对基因检测技术的选择、检测策略、检测流程等方面提供了指导性建议[1]。本文对共识中的诊断技术以及过往DMD相关病例研究进行分享与介绍。
一
遗传病理学
DMD基因是人类最大的基因，全长约2.3Mb，位于X染色体，肌肉亚型转录本由79个外显子组成，定位于肌膜且位于肌纤维的肋节处。具有4个主要的功能域，包括NH２端的肌动蛋白结合结构域、杆状结构域、富含半胱氨酸的结构域和羧基末端（如图1）。
图1. DMD基因结构示意图
DMD基因变异的主要突变类型包括大片段缺失和重复（1个外显子以上的缺失和重复）和微小变异。其中大片段缺失约占所有变异的68%，大片段重复约占10%，其余微小变异约占全部变异的22%。此外，也有一些DMD基因深度内含子和复杂基因重排的案例报道。
DMD基因基因型（缺失/重复变异）和临床表型的严重程度与编码蛋白的开放阅读框是否遭到破坏有关。
当缺失出现在DMD基因内，未改变阅读编码框时，翻译的蛋白质局部缺失，但可能仍具备某些正常功能，则可能导致BMD。
若缺失改变了蛋白质翻译的编码阅读框，则可能导致翻译提前终止，产生截短蛋白，从而诱导机体在mRNA以及蛋白质水平对表达产物进行降解，仅表达极少量的肌营养不良蛋白，导致DMD的发生。
上述阅读框理论在多数情况下可以预测变异将导致DMD还是BMD（如图2）。
图2. DMD基因外显子示意图
然而，上述规则也有例外，在某些情况下，肌营养不良蛋白完全缺乏者仅具有较轻的临床表现。
二
检测方法
01
多重连接探针扩增
DMD基因常见变异为缺失或重复变异，可通过多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技术进行检测。相关检测试剂盒针对每个外显子设计了单一的探针，能够检测所有79个外显子的拷贝数变化（如图3）。外显子的重复或缺失可能发生在dystrophin基因的任何位置，其中以第45~55外显子和第2~10外显子的缺失和重复最为常见。
需要注意的是，当MLPA 仅检测到单个外显子的缺失或重复时，应采用定量的方法如荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，Q-PCR)或定性的方法如Sanger测序加以验证，以避免探针结合序列中的点变异或多态性位点影响探针与模板的结合，从而导致假阳性或假阴性的结果。对于MLPA 检测到的外显子不连续缺失或重复，需进行进一步的验证(比较基因组杂交或RNA 分析)，以排除基因组内单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)导致引物无法结合所产生的假结果。
比如在2016年的文章中，作者在75个DMD基因单外显子缺失重复的患者中发现11个患者为SNP导致的假阳性[6]。
02
NGS技术、Sanger测序方法
若MLPA等方法未检测到DMD基因缺失或重复变异，而临床高度怀疑为肌营养不良蛋白病时，则需要采用测序的方法检测DMD基因的点变异或小的插入及缺失(即微小变异)。Sanger测序是检测dystrophin基因外显子微小变异的常规方法，该方法虽然准确但耗时耗力，目前临床广泛采用的是高通量测序技术，最常见的是靶向NGS(amplicon-based targeted NGS)，该方法能对dystrophin基因的所有79个外显子以及邻近的内含子区进行测序，此外,全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)、全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)也在dystrophin基因检测中逐渐得到应用。
03
RNA分析
对于DMD基因CNV和微小变异检测无阳性发现，但临床诊断又符合肌营养不良蛋白病的患者，须考虑可能存在MLPA、NGS技术检测范围之外的变异，如复杂重排、导致成熟转录本中出现假外显子或识别隐蔽剪接位点后产生新转录本的内含子深部的变异等。建议对这类患者进行RNA分析，即提取其肌肉组织RNA，利用靶向RNA-seq或全转录组测序的方法对DMD基因的转录本进行测序。拒绝肌肉活检的病例，可用干细胞或培养的尿液细胞获取RNA进行分析。在转录本中发现的致病变异，建议在对应的基因组序列中进一步进行印证。
在2021年的一篇研究中，作者通过对患者进行全基因组检测和尿液细胞RNA分析，发现了3个常规检测策略无法发现的变异，均导致了DMD基因的异常剪切[7]。
参考文献：
