文章内容来源自《Biomedical Engineering Advances 》“Medical diagnostic value of digital PCR (dPCR): A systematic review”一文，作者：Sophia Nazir，Wolfson Nanomaterials and Devices Laboratory, School of Engineering, Computing and Mathematics, University of Plymouth, Devon, PL4 8AA, UK
疾病检测技术的历史与局限：历史上血清学和培养方法在人类疾病检测和治疗中的应用，这些方法虽然相对便宜、易于操作且标准化程度高，但存在局限性，对于一些疾病的早期检测不够灵敏，尤其是在生物标志物含量极低的情况下。对于精确和早期检测威胁生命的疾病，监测高灵敏度生物标志物的重要性，这推动了基于分子的检测技术如PCR和qPCR的发展，但它们也存在各自的问题。
数字PCR的兴起与重要性：数字PCR作为第三代PCR技术，具有绝对定量目标核酸的能力，在一些方面克服了传统检测技术的局限性，因此在医学诊断领域具有重要的研究价值。
dPCR技术原理：1992年，Sykes等人首次提出dPCR用于绝对测量的概念，用于检测基因的重链突变。1999年，Vogelstein和Kinzler首次使用“数字PCR”一词，并开发了一种基于稀释和荧光检测的方法，此后该技术不断创新和商业化。数字PCR技术在不同阶段采用的多种形式，如基于微流体芯片、微阵列、微滴（基于油水乳液）以及类似qPCR的板等。
基本原理：dPCR将准备好的样品分成多个小隔间（纳米级），样品分子在其中随机分布，遵循泊松分布统计。每个隔间可能含有从零到多个分子，通过荧光检测扩增后的目标序列，分区中无分子计为0，有一个分子计为1，根据泊松统计计算密度和初始拷贝数以及扩增后的PCR阳性反应数量。
反应过程：dPCR是一个三步过程，包括样本分散（将DNA样本稀释到较低浓度，使反应室在扩增前理论上只有0或1个分子，但实际可能存在多个分子的情况）、扩增和信号监测（通过荧光探针检测扩增产物，单个扩增模板产生阳性信号，采用数字读出方法监测信号，避免了信噪比问题）。
dPCR技术的优势与劣势
优势：
灵敏度和准确性：具有超高灵敏度，能检测到极低浓度的目标分子，定量精确且结果可重复，不受污染影响，对抑制剂耐受性强。
定量方式：不需要参考材料进行定量，相比qPCR，能更准确地检测单分子差异，可检测到更小体积的目标分子，尤其是在存在大量非目标分子的情况下。
检测效率：在每个PCR循环中都能对扩增的目标序列进行定量，不受扩增效率变化的影响，可检测到更低的突变率。
多重检测能力：虽然大多数dPCR仪器使用两种不同染料测量荧光，但相比qPCR，其多重检测能力更强。
劣势：
技术复杂性：dPCR仪器通常采用泊松分布，理论上需要对分布进行校正。一些反应可能会发出异常强度的荧光，影响结果判断。
样本和试剂要求：与qPCR相比，每个反应的样本体积有限，动态范围较低，可能存在分子丢失导致错误定量，且不是所有分区都能扩增。
成本和复杂性：dPCR需要昂贵的试剂和仪器，样品制备过程复杂，增加了检测时间和成本，且存在污染风险。
数字PCR技术的应用
癌症检测：
癌症生物标志物：癌症是全球重大健康问题，早期诊断和治疗至关重要。dPCR可用于检测多种癌症相关的生物标志物，如cfDNA和ctDNA。cfDNA在健康和肿瘤细胞中都会释放到循环系统中，但肿瘤患者的cfDNA水平通常更高。在乳腺癌、肺癌、胃癌、白血病等多种癌症的检测中都有应用。例如，在乳腺癌中，ctDNA是重要的生物标志物，dPCR可用于其高精度、高灵敏度的检测和定量，有助于癌症的早期筛查、治疗监测和预后评估。
病毒检测：
多种病毒检测：dPCR可用于检测各种病毒，如SARS-CoV-2、CMV、HIV等。对于SARS-CoV-2，dPCR能准确检测低水平的病毒RNA，可使用鼻咽拭子采样，方便且提高了准确性，尤其适用于低病毒载量的样本和无症状患者。在病毒感染的早期诊断、病毒载量监测和抗病毒治疗效果评估等方面具有重要应用价值。例如，对于HIV，dPCR可用于精确测量HIV - DNA和RNA，优化对接受抗逆转录病毒治疗患者的监测。
非侵入性检测（产前诊断）：
胎儿染色体异常检测**：dPCR技术可用于非侵入性产前诊断，如检测胎儿染色体异常（如唐氏综合征）和单基因点突变等。通过检测母体外周血中的胎儿游离DNA（cffDNA），利用泊松分布对核酸序列分子进行定量，判断胎儿是否存在染色体异常。可用于诊断胎儿的单基因疾病，如地中海地区常见的地中海贫血症，通过检测母体外周血中的ccffDNA，确定胎儿的基因型。
dPCR技术是一种强大的分子诊断工具，在癌症检测、病毒检测和非侵入性产前诊断等方面具有显著的优势，但也存在一些局限性，如技术复杂性、成本较高和多重检测能力有限等。
未来展望：
自动化和成本降低：目前dPCR平台需要计算机化和成本降低，试剂和仪器昂贵，样品处理复杂，未来需要开发更简单、快速、准确和经济的检测方法。
多重检测：dPCR技术在多重检测方面存在局限性，需要进一步改进技术，提高多重检测能力，以满足临床应用的需求。
与其他技术整合：与CRISPR整合：dPCR可以与CRISPR基因编辑技术整合，提供一种快速、实时、敏感和精确的检测方法，用于检测病原体和癌症。
