新型递送系统VLP的专利策略（一）

上篇序中我们提到，VLP在传统的逆转录或慢病毒载体上进行删减，去除了包含包装信号的LTR下游序列，只保留负责组装成病毒包膜和衣壳的Gag-Pol蛋白。VLP如何能够在衣壳组装过程中将mRNA、蛋白或RNP包装到壳内，是解决VLP高效递送所面临的关键问题之一。接下来的文章中，我们将和大家分享领域内围绕VLP包装mRNA和RNP的主要设计思路，以及相关的专利问题。

VLP包装mRNA

野生型逆转录病毒通过基因组LTR下游的包装信号Ψ结合Gag蛋白的NC域，实现基因组核酸的包装，那么VLP要实现mRNA包装，就需要人工创造特异性结合。我们发现，领域内玩家主要通过在衣壳和待递送的GOI之间安装“特异性识别和连接的纽扣”，来驱动衣壳包装mRNA，具体思路是：

1. 在待递送GOI质粒中插入适配体RNA

2. 在衣壳蛋白表达载体中插入适配体结合蛋白

3. 依赖RNA与RNA结合蛋白的相互识别和结合，驱动衣壳蛋白在组装的过程中识别并包装mRNA以实现包装效果

图1 基于适配体-适配体结合蛋白的VLP-mRNA递送（改编自doi: 10.1093/nar/gkz605）

这个纽扣借助了各种成熟的“适配体RNA-适配体结合蛋白（Aptamer-binding protein）”体系，比如使用MS2衣壳蛋白（MS2CP）和特异性识别并结合具有发夹-茎环loop的MS2适配体RNA，这应该目前应用最广泛的体系。这一开创性的研究起源于Jean-Christophe Pagès团队，团队成员构建了MS2嵌合的慢病毒VLP，实现了包括Cre重组酶在内的多种类型RNA的高效包装和小鼠体内瞬时递送。

这一研究也是后续VLP能够递送Cas9 mRNA的基础，通过构建Cas9-MS2 RNA融合质粒和sgRNA-MS2融合质粒，Galla团队实现了VLP同时包装和递送Cas9 mRNA和sgRNA（all-in-one）。后续Baisong Lu、David Liu团队又陆续验证了COM蛋白–Com RNA、PCP蛋白-PP7 RNA以及λ N22-BoxB RNA等蛋白-RNA适配体的其他纽扣体系，辅助VLP递送的可行性。

图2 基于MS2体系的VLP-(Cas9 mRNA+sgRNA)递送（参见doi: 10.1016/j.omtn.2018.09.006）

以MS2为代表的各种适配体系统很早被开发、并被广泛应用到多个领域，因此该适配体系统本身的潜在专利侵权风险大概率已经届满失效。但需要注意的是，该类适配体系统应用到VLP、甚至应用到CRISPR系统本身出现得很晚，关键性的开拓人有可能能够获得比较宽泛的平台性质的专利保护。例如，US11124775B2授权专利的权利要求，保护了涉及衣壳化序列及其结合域序列组成的逆转录病毒颗粒，其中衣壳化序列可以为MS2的茎环序列，结合域序列可以为MS2的外壳化序列，没有限定递送的基因，可以涵盖任何利用MS2体系的VLP-mRNA递送。诸如这类的专利，可以算作领域内保护范围比较宽泛的基础专利风险，对于企业来说，在立项早期排查和发现这类宽泛风险、做到心中有盘，可以为后续风险管控和解决争取更多的时间和自由度。

在利用已有的“纽扣体系”初步实现VLP的mRNA包装和递送后，领域内更多的工作就集中包装效率的优化工作，与之相关的因素包括纽扣插入的拷贝数、衣壳蛋白Gag以及sgRNA骨架中的插入位置等。

代表性的研究可以参考2021年蔡宇伽团队围绕基于MS2的慢病毒VLP-CRISPR递送系统（mLP-CRISPR），团队测试了MS2衣壳蛋白缀合在衣壳蛋白Gag N端vs. Pol C端、缀合MS2衣壳蛋白单体或二聚体以及MS2茎环拷贝数（x3/6/12）对包装和递送效率的影响。

图3 mLP-Cas9系统（参见doi: 10.1038/s41551-020-00656-y）

由于该类工作是对VLP-mRNA递送平台的进一步优化，预计相关的发明能够获得的专利保护范围也会相对有限，往往会需要限定到优化的具体细节特征。对于以开发活性分子为核心、计划直接利用领域内现有的高效VLP递送系统的企业，我们建议，在研发早期筛选候选优化版的递送系统时，可以综合考虑各个版本的潜在风险情况辅助决策，以管控VLP递送系统带来的潜在侵权风险。

在CRISPR系统的VLP-mRNA递送体系中，不可忽视的一个问题就是sgRNA的递送效率。有研究发现MS2缀合的sgRNA，递送效率仍然很低，推测原因可能在于没有修饰的sgRNA（无cap和多腺苷酸化等）在胞内半衰期较短；而VLP递送Cas9 mRNA需要经历蛋白表达，在此期间sgRNA会持续被降解，大大降低了CRISPR系统的编辑效率。

众所周知，RNP有利于提高sgRNA的稳定性，并且Cas9不用经历体内表达过程就能发挥编辑活性，越来越多的研究转向更有利于瞬时递送的VLP-RNP体系。

VLP包装RNP

而VLP递送RNP的难点主要在于蛋白的识别和包装。在系统性梳理领域内的策略时，我们发现设计原则还是人工创造待递送蛋白与衣壳蛋白之间的特异性连接，落实到具体手段上主要分两种：1）延用“纽扣”体系和2）Gag融合策略。

延用“纽扣体系”是前述VLP-mRNA递送策略的衍生，通过MS2融合sgRNA，又凭借衣壳组装过程中sgRNA与Cas9共价结合形成RNP，来驱动VLP包装RNP。

图4 VLP-mRNA衍生的适配体体系应用到VLP-RNP（改编自doi: 10.1093/nar/gkz605）

由于该方法是在前述VLP-mRNA设计思路上的衍生，使用类似手段同样会受到前述VLP-适配体平台类相关专利的影响。除此之外，该方法又融合了RNP，特别在CRISPR领域，需要警惕2种原理结合以实现VLP递送CRISPR复合物的方法专利。

而另一种策略则更直接，直接利用包含蛋白酶切割位点的linker将外源蛋白融合到Gag上。回顾病毒基因组结构和衣壳组装过程，Gag包含形成衣壳支架的各种蛋白域（MA、CA和NC），Pol编码多种组装过程所需的酶（PR、IN、RE）。在病毒载体生产过程中，包装质粒表达形成的Gag被Pol蛋白表达的蛋白酶（PR）切割形成多个结构蛋白域、从而进行组装形成病毒的外壳。

图5 基于Gag融合的VLP-RNP递送（改编自doi: 10.1038/s41467-018-07845-z ）

Christine Voelkelhe、Stanislaw J Kaczmarczyk团队在2011年左右的研究相继发现，通过与Gag蛋白融合，外源蛋白能够随着衣壳蛋白表达、蛋白酶切割、衣壳组装过程被VLP包装到衣壳内部。

US9296790B2授权专利正是保护与之相关的发明，权利要求保护一种VLP，包括Gag-目标蛋白融合体和具有靶向识别功能的包膜蛋白，对于目标蛋白的种类，可以为细胞毒性酶、干扰素、肿瘤抑制剂、重组酶、激素或干细胞转录因子。对于主要开发这类活性分子的企业，若选择VLP-蛋白递送，该专利会是一个比较大的障碍。

在CRISPR系统被广泛认识为强有力的基因编辑工具后，很多研究团队也开始开发基于Gag融合的VLP-Cas9、VLP-RNP蛋白递送，这其中就包括基因编辑领域的领先人Jennifer A. Doudna利用VLP-RNP编辑T细胞、David R Liu开发了针对BE（Base Editor）和PE（Prime Editor）的eVLP。

TiPLab小贴士

对于利用VLP递送CRISPR系统开发的基因编辑药物的玩家来说，我们认为，要警惕来自各种包装策略的开拓者，保护宽泛平台类的专利障碍，例如适配体系统用于包装mRNA、Gag融合包装蛋白等相关技术引入的潜在风险；除此之外，也需要密切关注VLP应用到Cas9 mRNA或RNP相关的潜在风险专利。那么对于在现有开拓性递送方法基础上持续优化VLP包装和递送效率的玩家来说，在专利申请与保护上有什么要注意的呢？我们将在下一篇和大家分享。

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