基因编辑专题
基因编辑技术由于其从致病源头上改变序列的能力，为此前治疗希望渺茫的患者提供了改善或治愈的可能性，从而备受瞩目。2023年底，FDA批准首个CRISPR基因编辑治疗药物Casgevy，对于整个基因编辑领域具有里程碑式的意义。在本次基因编辑会场，我们分享了6个前沿研究工作并探讨了新编辑系统发现或已知编辑系统改造的专利保护问题。
在真核生物体系下进行基因编辑的RNA引导的DNA切割酶（Fanzor）（张锋团队，Nature，2023）
基因编辑领域的领军人物张锋团队近期发表在Nature正刊上的研发成果——即一种源自真核生物并且可以在真核生物体系中发挥基因编辑作用的酶（Fanzor），以及利用该Fanzor酶、可用于真核生物背景切割的基因编辑系统。
张锋团队通过研究发现，Fanzor与Cas12的祖先TnpB存在一定的亲缘关系；同时结构生物学的数据支持，Fanzor所包含的各个重要的结构域能够分别发挥与靶区域对应的DNA序列的识别、结合作用，以及切割双链的作用。
试验还进一步证实，Fanzor可以有效地对目标核酸双链进行切割，特别是对人源基因进行特异性高效切割。此外，通过定点突变等工程化改造，Fanzor的切割效率能够被进一步提高（甚至高于同等情况下Cas12的切割水平）。可见Fanzor，以及利用Fanzor的OMEGA基因编辑系统，进一步扩大了基因编辑的工具箱。这必然有助于基因编辑在真核生物领域继续发挥作用，具有非常可观的潜在商业价值。
以张锋团队的Fanzor酶所对应申请的权利要求为例，他们明确并验证了发挥内切酶活性的关键区域Ruv-C域和基因编辑敲除效果之间的位效关系，从而从仅限定该关键区域的角度出发，尽量扩大所争取的保护范围。
优化I-F型CAST系统实现哺乳动物中无DSBs的靶向DNA整合（Samuel H. Sternberg团队，Nature Biotechnology，2023）
CAST系统是CRISPR系统的靶向定位功能结合转座子的DNA切割和插入功能衍生出的基因编辑新工具，该系统可实现无双链断裂（DSBs）的靶向DNA整合。
近年来，Samuel团队从原核生物中鉴定出一种I-F型CRISPR相关转座酶系统，该系统由类Tn7转座子部分以及CRISPR-Cas部分组成，其中CRISPR-Cas部分包含Cas6、Cas7和Cas8三种蛋白以及crRNA，负责CAST系统的靶向定位，类转座子部分包括TnsA、TnsB、TnsC和TniQ四种蛋白，负责靶DNA链的切割和插入。该系统多个组分间相互配合，共同完成基因编辑。
鉴定出I-F型CAST系统后，Samuel团队进一步地对其进行了探究，期望能将它作为真核生物的基因编辑工具。对于这种多组分共同起效的系统，Samuel团队对CAST系统的元件、载体、辅助因子等多个方面均进行了优化，提高了系统整体的DNA整合效率。
对于多组分共同产生作用的系统的开发与改进，在清楚各部分功能的情况下，由于每个元件具有的功能不同，去掉每一个元件都会使系统整体失去它的作用，因此在考虑专利保护时我们需要将其作为一个整体进行保护。
对于新系统，可以尝试限定系统中的主要组成元件的类型，而不限定其中元件的具体结构特征，例如具体的序列来扩大保护范围。
而对于已有的系统的进一步优化，即使是对其中的部分元件进行了改造，考虑到优化后的元件难以单独发挥系统的功能，所以仍然可以尝试对系统整体进行保护。其中优化后的元件需要限定具体的优化特征，并且可以将不同的优化方向设置为不同的保护方向，对于未经过优化的元件可以进行多方向展开，从而尽可能地阻止竞争对手。
基于R2非LTR逆转录转座子机制，构建一种新型的RNA引导的基因插入工具（张锋团队 ，Science，2023）
逆转录转座子通过将RNA模板逆转录后整合到靶标位置，避免了双链断裂导致的安全性问题，同时避免了直接插入外源DNA引发先天免疫反应的问题。本篇文章结合逆转录系统和CRISPR系统，构建一种由RNA介导插入的新型基因编辑系统。逆转录转座是将自己的DNA在宿主细胞中转录成RNA，之后通过逆转录蛋白的作用合成cDNA插入宿主基因组中。但目前逆转录过程的具体机制尚不清楚。
张锋团队依据天然的逆转录过程体外构建逆转录复合体，探究该复合体各元件之间的相互作用，明晰了天然逆转录过程的作用机制。首先N-ZnF和Myb结构域特异性识别靶DNA上的特殊位点，之后RLE特异性切割靶DNA，靶DNA上形成切口，切口链围绕另一条链旋转，将切口链带入逆转录酶（RT）样结构域，在该区域RNA 3’末端与切口链互补配对，最后在逆转录酶样结构域作用下启动逆转录，合成cDNA。
但此处构建的R2逆转录系统只能靶向28S核糖体基因组，无法靶向其他DNA。因此张锋团队进一步改造了R2系统，使用sgRNA和Cas9蛋白替代天然逆转录系统中特异性识别和特异性切割靶DNA的部分。
本篇文章属于已知基因编辑系统的新机理研究，在专利角度，机理研究属于科学发现，无法直接获得专利保护，可以考虑基于新机理开发的系统或是应用进行专利保护。
具体而言，可以从“产品”和“方法”的角度进行保护。“产品”指的是系统中的活性成分，包括系统元件和系统组成。“方法”指的是系统的应用，比如生产扩增方面的应用，治疗疾病方面的应用等。
以R2逆转录系统为例： 对于系统元件而言，可以是保护改造的酶的结构、其突变位点或具体序列。 对于系统组成，可以通过限定系统中发挥关键作用的元件结合其他元件的拓展进行保护。 对于系统应用，可以保护其中元件的用途，比如R2逆转录酶可以用于生产扩增；也可以保护整个系统的用途，比如使用改造的基因编辑系统来治疗疾病等。
调控多靶点转录组RNA的CRISPR/Cas13d平台及其在人原代T细胞中的应用（Lei S. Qi团队，Cell，2024）
CRISPR/Cas13系统（也称为Type VI型），是目前CRISPR系统Class II分类中，筛选鉴定的一支具备RNA编辑功能的系统。该系统同样需要核酸酶和引导RNA两部分组合发挥编辑作用。
Lei S. Qi团队基于CRISPR/Cas13d系统建立了多靶点RNA调控平台，具体来说通过将引导RNA串联，实现多个靶点RNA的同步调控。进一步在Cas13d酶的C末端融合功能结构域二氢叶酸还原酶，通过控制添加小分子抗生素TMP，实现系统的可调控性。最终，Lei S. Qi团队将该系统应用于细胞衰竭问题比较显著的CAR-T细胞，通过组合调控相关通路靶点，提高CAR-T细胞的增殖能力与肿瘤清除能力。
现阶段基因编辑领域，在新的基因编辑系统被首次鉴定后，进入该领域的后发者一部分会参照已知系统的主要结构特性，筛选同样具备核酸酶切割活性的新分支系统（例如CRISPR/Cas12a被首次鉴定后，陆续拓展鉴定出CRISPR/Cas12b、CRISPR/Cas12i等）；另一部分玩家则侧重于推进已知编辑系统的应用，例如基于已知系统开发新的衍生编辑平台（基于CRISPR/Cas9系统的DNA碱基编辑器），或将已知系统应用于具体产品管线的开发。
对于第二类借助已知编辑系统开发衍生编辑平台或者开发相关产品的玩家，在专利布局方面，可以尝试争取应用层面“次宽”的保护范围。
对于衍生编辑平台类的开发应用，CRISPR/Cas系统作为这类编辑平台组成中的一部分，在所选的系统本身已经成为现有技术的情况下，后来者在参考相近领域的设计思路进行衍生编辑平台开发时，研发速度以及衍生平台的技术效果对这类系统获得“平台型次宽”的保护范围的抢占至关重要。
而将已知系统应用于具体产品管线开发的玩家，早期专利布局时则可以考虑争取“产品型次宽”的保护范围，围绕未来的商业化产品进行保护，可以根据所选编辑系统本身的技术特点，结合未来产品的应用场景中大概率会出现的技术特征，优先考虑通过“产品特征+系统特征”的策略整体保护一类产品，更大程度上阻止潜在竞争对手。
高精度新型腺嘌呤碱基颠换系统AXBEs & ACBEs（李大力团队&David R. Liu团队，Nature Biotechnology，2023）
华东师范大学李大力课题组在2023年6月的研究论文开发了一系列腺嘌呤颠换编辑工具（AXBEs和ACBEs），并且证明了ACBEs在不同细胞系与小鼠胚胎中的高效性与精确性。
碱基转换可通过碱基脱氨实现，而碱基颠换（如嘌呤转化为嘧啶）则需要切除嘌呤脱氨后的肌苷，以创建无嘌呤无嘧啶（AP）位点，随后进行碱基切除修复途径（BER）完成。鉴于内源糖苷酶低效的肌苷切除修复能力，华东师大研究人员将几种对肌苷有潜在催化活性的糖苷酶与腺苷脱氨酶TadA-8e和nCas9融合并筛选碱基编辑效果，发现小鼠来源的烷基腺苷DNA糖苷酶（mAAG）可实现一定几率的碱基颠换。同时，基于结构导向的理性设计和筛选鉴定出关键突变体mAAG-EF，实现底物肌苷的高效切除活性。
另外，研究表明，在TadA-8e中引入N108Q突变，可进一步显著减少碱基颠换编辑器A到G的副反应突变，且使其更加精准地编辑sgRNA的A4-A6位，精确度最高可提高了171倍，所产生背景水平的Cas9非依赖性的平均脱靶效率低于0.3%，展现出较高的应用安全性。
从本篇文献的分享，我们可以看出，这种新型腺嘌呤颠换编辑工具ACBEs是一类基于已知功能的酶应用到新编辑工具/系统的研究发明，在进行此类发明的专利申请布局时，我们需关注新工具或新系统与现有技术相比，是否具备能够使其区别于后者的关键技术特征。
所谓“关键技术特征”，可以是从实验揭示的构效关系、作用机理中获得，例如，我们发现了某一类核酸酶都具备特定结构域，并且该特定结构域的存在与否直接决定其能否行使某类功能；也可以通过对一定范围内筛选出的候选对象的共性进行总结，推断出潜在的关键技术特征，此时要注意针对性地准备实施例和数据，以落实推断。
此外，关键技术特征以外的其他重要技术特征，往往起到阻止竞争对手进行局部区域的二次开发，或者阻止其进行较低成本的规避设计。因此，尽可能争取其他重要技术特征的授权范围，也对提高专利价值有着重要意义。除了保护新编辑工具/系统本身，还需关注对其上游工艺、筛选酶的方法，以及下游的临床应用场景等延伸专利的保护。
嵌合Cas9酶提高PAM灵活性：从识别5′-NGG-3′ PAM到识别5'-NNN-3' PAM（Pranam Chatterjee团队，Nature Communication，2023）
CRISPR系统主要分为两个组分，一是发挥定位剪切作用的Cas酶，二是sgRNA序列，靶向基因组区域。Pranam Chatterjee团队的研究是对该系统的其中一个组分（即，Cas9酶）进行了改进，设计了更优的迭代版本。该团队构建的Cas9-SpRYc由两部分组成，第1-1119位是犬链球菌ScCas9的变体Sc++，第1119-1377位是酿脓链球菌spCas9的变体SpRY的PAM相互作用结构域。
对于这样的组分改进，专利保护的难点在于现有技术较多的情况下，如何设计合理的保护范围，在保护具体改进内容的基础上尽可能地争取较大的保护范围，去阻碍竞争对手。
结合刚刚介绍的嵌合酶Cas9-SpRYc，我们认为，可以从两个角度去考虑Cas酶改进的专利保护策略。第一个角度是可以对单个Cas酶进行保护（例如，限定序列同源性的形式进行保护），第二个角度是可以去保护嵌合酶的组合，以及组合后的具体序列。
对于单个Cas酶来说，我们认为“限定同源性+突变位置/具体突变类型”的权利要求可能是可以争取的合理保护范围，相对于限定到具体序列的权利要求，能够阻止的竞争对手更多且更容易获得授权，但需注意的是，对于“同源性类型”的权利要求，不同国家的审查尺度是不同的。
综上，我们分享了以上6项前沿研究工作并探讨了相应的专利保护策略，这些研究工作代表了目前基因编辑领域典型的几类创新场景：新编辑系统的发现、Class I系统研究、解析已有系统的机理、设计已有编辑系统的衍生系统、已有编辑系统的应用或改造等。
首先，对于这些不同类型的创新场景，总体上都可以从基因编辑系统及其组成、基因编辑系统的用途、衍生系统及其组成来考虑专利可保护的发明点。保护基因编辑系统的组成需要明确系统的关键元件，比如，CRISPR/Cas9系统主要由核酸酶和sgRNA组成，在专利保护上就可以单独地去保护核酸酶或sgRNA，比如，核酸酶的突变体、截短体、sgRNA序列等；保护基因编辑系统的用途，可以保护基因编辑治疗的不同适应症、诊断用途等；保护基因编辑系统的衍生系统（例如，DNA碱基编辑器），也可以保护衍生系统的组成、衍生系统的用途等。
其次，在明确专利可保护的发明点的基础上，公司需从未来的产品形式和商业竞争格局等角度出发，选择有价值的发明点来进行专利保护。
再次，对于技术衍生的核心产品，随产品开发进程递交多件专利申请，构建专利壁垒是专利布局的重点。
总之，在技术向商业转化的价值链条中，专利起着不可忽视的作用。对于技术创新者来说，明确自己的创新属于哪种类型，在技术或产品研发早期就着手进行专利布局尤为重要。除专利布局以外，对于基因编辑领域的创新（例如，已有编辑系统的改造），还建议在合适时机进行针对性潜在侵权风险排查并采取应对措施，以便技术或产品未来能自由实施。
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