抗击弗朗西丝菌感染：现行疫苗策略与新方法

摘要:兔热病是由弗朗西斯氏菌属的亚种引起的，可以表现为多种疾病状态，其中肺炎型的表现导致最高的死亡率。尽管经过数十年的研究，美国仍未批准针对弗朗西斯氏菌的疫苗。传统的疫苗接种策略，如减毒活疫苗或亚单位疫苗，由于保护不足或安全问题而不受青睐。因此，需要新的疫苗接种策略来对抗兔热病。在这里，我们讨论了兔热病疫苗领域的当前状态和挑战，并提出了可能更适合预防弗朗西斯氏菌感染的新型疫苗方法。

1.对弗朗西斯氏菌感染的免疫反应

兔热病是由革兰氏阴性的兼性细胞内细菌弗朗西斯氏菌引起的。通过昆虫叮咬、接触感染动物（如兔类或其他啮齿动物）或吸入气溶胶感染弗朗西斯氏菌；细菌也可以在土壤或水中找到，如图1所示。这些不同的传播途径可以导致多种疾病表现，包括溃疡性腺型、腺型、眼腺型、咽型、肺炎型和伤寒型，其中肺炎型和伤寒型显示出最高的死亡率。弗朗西斯氏菌有两种亚型——A型，弗朗西斯氏菌亚种（弗朗西斯氏菌）和B型，弗朗西斯氏菌亚种。A型是细菌的更具毒力形式，更常与人类的严重疾病相关，而B型通常不会引起严重疾病。2019年，美国报告了274例兔热病病例，欧盟报告了1,463例，A型在北美更常见，B型在欧洲更常见。气溶胶传播和吸入导致最严重的兔热病形式：肺炎型。理论上，仅25个菌落形成单位（CFU）就能引起肺部疾病，使其成为通过气溶胶途径传播的最传染性细菌病原体之一。由于其低感染剂量和肺炎形式的高死亡率，弗朗西斯氏菌被CDC指定为一级选择剂，管理微生物的拥有和研究活动。弗朗西斯氏菌作为生物威胁剂也有不光彩的历史，并且曾被几个国家武器化。

对弗朗西斯氏菌的免疫反应已经被很好地描述，并且其他人已经写过全面的综述，因此这里只简要介绍。对弗朗西斯氏菌的免疫反应非常复杂，包括细胞和基于抗体的反应。在弗朗西斯氏菌感染后，B细胞和T细胞都被激活。抗体发挥重要作用，有助于识别LPS或外膜蛋白；然而，从接种弗朗西斯氏菌活疫苗株（LVS）的小鼠血清转移不能保护免受弗朗西斯氏菌的肺部挑战，这表明交叉反应性抗体反应不足以提供保护，至少对肺部疾病来说是如此。弗朗西斯氏菌的LPS是四酰化的，弱激活TLR4，因此不诱导炎症细胞因子。当用弗朗西斯氏菌预处理的小鼠血清被动转移时，接受者小鼠可以从随后的挑战中得到保护，但前提是T细胞完整，这突出了细胞介导反应在保护中的作用。B细胞可能在二次感染中发挥更重要的作用，可能有助于抗原呈递，并在感染期间产生重要的细胞因子和趋化因子。弗朗西斯氏菌可以感染B细胞导致凋亡，可能妨碍其功能，这可以解释它们在感染中不太明确的角色。抗体滴度似乎不是疫苗效力的可靠标志，完整的T细胞反应对感染控制至关重要。αβ、γδ和粘膜不变T细胞（MAIT）已被证明有助于动物模型中的清除和保护性免疫。产生IFNγ和TNF的Th1 T细胞需要控制感染，尽管IL-17、IL-2和IL-12的作用也被描述。先天免疫也有助于保护，NK细胞可能在T细胞反应启动前产生IFNγ。与其他细胞内病原体一样，弗朗西斯氏菌可以利用宿主细胞如巨噬细胞和树突状细胞通过细胞内复制，但IFNγ可以通过活性氧抑制这种生长。中性粒细胞也被认为是对弗朗西斯氏菌的初步反应，缺乏中性粒细胞的小鼠迅速死于感染；然而，这可能取决于感染途径，因为缺乏中性粒细胞对呼吸道感染的影响较小。中性粒细胞在人类感染中的效应机制不太清楚，特别是因为感染弗朗西斯氏菌的中性粒细胞不会发生呼吸爆发。除了IFNγ，TNF和IL-12对初始感染控制至关重要，尽管它们被检测到的速度取决于感染途径。尽管对先天和适应性免疫反应对弗朗西斯氏菌的作用有一些了解，但这些反应如何共同产生长期保护仍不清楚。图2简要描述了感染期间肺部和鼻腔的免疫学。

图2. 针对弗朗西斯杆菌肺部感染的免疫反应假设。弗朗西斯杆菌可以通过呼吸道途径感染，首先可能遭遇富含免疫细胞的鼻粘膜。尽管关于弗朗西斯杆菌在鼻粘膜中的宿主-病原体相互作用知之甚少，但很可能病原体在鼻相关淋巴组织中被摄取，那里的先天和适应性免疫细胞都会产生免疫反应。一旦越过鼻粘膜，细菌可以进一步被吸入肺部，在肺泡腔中，弗朗西斯杆菌已经适应优先感染肺泡巨噬细胞。在肺部，树突状细胞对于摄取和呈递细菌抗原给适应性免疫细胞，特别是T细胞，非常重要。促炎细胞因子如IFNγ和TNF对于帮助对抗弗朗西斯杆菌感染是必需的。B细胞和抗体，特别是肺部的IgA，在弗朗西斯杆菌免疫中扮演重要角色，但这种免疫主要依赖于细胞介导的免疫，单独并不足以提供保护。由于肺部高度血管化，弗朗西斯杆菌可以轻易地从呼吸道传播到循环系统并引起系统性感染，因此在创建新疫苗时，理解诱发适当免疫反应至关重要。使用BioRender创建。

2.弗朗西斯氏菌感染保护的疫苗相关性

在开发有效的弗朗西斯氏菌疫苗方面，最显著的成就是活疫苗株（LVS）的开发。这个株是在20世纪60年代在苏联通过减毒F. holarctica  而创建的。由于它无法提供对人类致病性F. tularensis的完全保护，并且存在可能恢复成更具致病性的细菌形式的担忧，这种疫苗目前在美国尚未获得许可。原始的LVS株经过高度传代，使其对完全致病性菌株的效力降低。LVS还可以自发地转变为更减毒的形式，这也未能提供保护。自然感染弗朗西斯氏菌可以导致对感染的保护，表明免疫是可能的，基于自然感染的疫苗应该能够提供保护。在人类中，LVS疫苗诱导CD4+和CD8+ T细胞、γδ T细胞、NK细胞和单核细胞的扩增，引发模仿弗朗西斯氏菌感染的宿主反应模式。尽管在人类兔热病气溶胶挑战研究中免疫细胞扩增，但只有54%的LVS接种志愿者受到疫苗保护，因此不需要额外的抗生素治疗来清除细菌。因此，几乎一半（46%）的挑战志愿者未受到LVS疫苗的保护，突显了这种疫苗对最致命疾病形式的低效力。虽然这种保护取决于接种剂量和挑战途径，但这强调了LVS疫苗在大多数情况下不足以完全保护免受致病性弗朗西斯氏菌暴露。近年来，研究寻求识别小鼠和大鼠在F. tularensis呼吸道感染后的潜在保护相关性，以更好地理解必要的疫苗属性。B细胞和抗体、T细胞以及控制巨噬细胞内细菌生长的作用都被确定为重要因素，但对于疫苗介导的后续感染保护的确切平衡仍不清楚。值得注意的是，最近一项研究检查人类对LVS疫苗接种的免疫相关性表明，T细胞产生的细胞因子IFNγ、TNF、IL-17和IL-2与单核细胞衍生的巨噬细胞在体外杀死高致病性SchuS4株最为相关。此外，这项研究还显示了CD4和CD8记忆T细胞反应的范围，这些反应在接种后持续超过一年。

已经确定T细胞与疫苗介导的保护相关，在某些情况下绝对需要。然而，直到最近，还不清楚循环或组织驻留T细胞是否需要保护。最近，Roberts等人。使用共生和血管内染色技术，表明循环和驻留T细胞都是必需的；然而，这两种细胞类型本身都不足以提供保护。这表明两种T细胞类型都很重要，特别是因为弗朗西斯氏菌容易从最初的感染部位传播到远端组织。从历史上看，抗体反应被用作疫苗反应的测量，但对于细胞内病原体，抗体可能不那么相关。细胞介导保护的相关性更适合保护这些类型的生物。对于弗朗西斯氏菌，当比较疫苗株的保护能力时，抗体反应和谱系的明显差异并不总是存在。主要推动体液反应的疫苗策略不能单独提供保护；细胞介导的免疫也是一个要求。与严重疾病保护相关的上调基因组包括NOS2、IL-21、CCL5、LTA、FasL、IL-2RA、IFNγ和CXCL9。最近，这个基因组使用A型菌株衍生的疫苗候选物ΔclpB进行了验证，该候选物在高剂量同源菌株的气溶胶挑战中显示出部分保护。虽然这个基因组有望识别细胞介导的保护相关性，但Roberts等人的研究也强调了创建疫苗以保护免受播散性感染的挑战。因此，识别相关性是必要的，但同样重要的是使用适当的感染挑战方式和疫苗递送途径来全面评估免疫原性和保护效力，以实现最佳保护。

3.研究弗朗西斯氏菌疫苗反应的动物模型

弗朗西斯氏菌有多个宿主，在感染期间有多种临床表现。因此，建立适当的动物模型来研究免疫反应，从而开发适当的疫苗，仍然是一个复杂且生物学上复杂的工作。大部分过去的研究集中在肺炎形式上，因为它的高死亡率和可能的生物恐怖主义威胁。非人灵长类动物（NHP）、兔子和各种啮齿动物（小鼠、大鼠和豚鼠）都被用作研究弗朗西斯氏菌感染和免疫学的模型，NHP最接近人类疾病。已经使用几种NHP物种来研究兔热病，包括Chlorocebus aethiops（非洲绿猴）、Macaca fascicularis（猕猴）和Macaca mulatta（恒河猴）。猕猴的肺炎兔热病已经发展到被认为是可接受的疾病模型，用于医疗对策发展。包括小鼠在内的啮齿动物物种，无论是BALB/c还是C57Bl/6株，通常被用作疾病模型，因为对低剂量F. tularensis的敏感性导致系统性疾病，与人类宿主反应有一定的相关性。流行的小鼠模型已经显示出对LVS的不同敏感性，这取决于选择的小鼠株、使用的弗朗西斯氏菌株和接种途径。小鼠特别容易受到腹腔内LVS感染，理论上需要1个（1）CFU来诱导疾病；然而，这个途径和模型的含义不清楚，因为腹腔内感染不是兔热病的自然途径。对于包括皮内注射或通过气溶胶吸入在内的自然感染途径，小鼠株需要不同的剂量来诱导可能导致致命性疾病，这使得很难将这个物种的宿主反应完全转化为其他模型。小鼠也容易受到F. novicida的感染，F. novicida是与F. tularensis密切相关的物种，已经被研究用作LVS或弗朗西斯氏菌A型株的替代品，因为它在小鼠中引起类似兔热病的疾病。尽管观察到一些剂量和途径的差异，F. novicida可以是评估新型疫苗候选物和进行机制研究的有价值的工具。Fischer 344大鼠也可以模仿人类的易感性，但通常需要比人类疾病诱导所需的剂量更高，这可能质疑它们在模拟人类疾病方面的效用。尽管如此，大鼠能够耐受更高剂量的能力使它们成为气溶胶挑战的模型，这与人类疾病高度相关。兔子，作为弗朗西斯氏菌的自然宿主，可以重现人类病理和疾病。豚鼠，虽然是一个不太明确的模型，主要用于测试LVS对挑战的保护，并且不清楚这个模型中的疾病与人类疾病的匹配程度。关于这些动物模型的进一步讨论，可以在Roberts等人和Lyons和Wu的著作中找到。动物模型对于新弗朗西斯氏菌疫苗的开发至关重要，这既是由于感染的罕见性和其相关的致命性。新的疫苗候选物可能会在FDA动物规则下进行评估，因此了解每个模型的优缺点是必要的，以实现理想的保护反应，并确定测试和评估免疫原性和有效疫苗所需的保护相关性。

4.当前弗朗西斯菌疫苗的方法

4.1.活减毒和灭活全细胞疫苗

自从LVS（活疫苗株）开发以来，人们一直在努力开发更有效的疫苗。如前所述，当前的LVS对完全致病株的效力不足；这个菌株还显示出混合菌落形态，使得不同批次间的免疫原性难以调控。由于在减毒过程中发生的自发突变，它还缺乏通常在弗朗西斯菌中发现的IV型菌毛。IV型菌毛是一种强效抗原，可能是LVS免疫原性降低的原因。在临床实践中，作为减毒活疫苗的LVS在免疫接种期间对敏感人群具有不可接受的高反应原性风险。自LVS开发以来，已有众多团队致力于创造新型弗朗西斯菌疫苗候选物，其中许多列在表1中。虽然不是穷尽的，但列表突出了疫苗设计中采取的不同方法及其随后的结果。由于原始LVS显示出中等效力，其他人已经构建了一个使用现代良好生产规范的改良LVS，以满足当前人类测试的标准。一种新的LVS菌株在兔子中耐受良好，并产生了高抗体滴度，没有细菌在肝脏或脾脏中定植。这种新的LVS批次最近在2期临床试验中进行了测试，对人类志愿者的疫苗接种显示了轻微到中度的不良临床事件（例如，不适，头痛，肌肉疼痛，喉咙痛），被认为是轻微的反应原性，但导致了强大的血清转换。尚不清楚接种后产生了哪种抗体亚型（IgG，IgM或IgA），或者诱导了哪些细胞免疫反应，因为没有关于T细胞激活的数据，这使得很难将这种新的LVS候选物与原始配方的效力进行比较，特别是考虑到，如前所述，T细胞需求是保护的相关因素。其他临床试验表明，用这些新产生的菌株进行疫苗接种引起了脂质组、蛋白质组、代谢组和转录组的变化，这些变化与炎症增加、抗原呈递和蛋白质处理相关，可以洞察到实现适当免疫反应以对抗兔热病的必要性。已经产生了LVS的敲除菌株，以确定它们与野生型LVS的效力比较。LVS的ΔclpB突变体显示出对LVS挑战的保护，体重减轻最小，细菌清除增加。另一项使用ΔclpB突变体LVS的研究显示，在SchuS4挑战后有40%的存活率。随后另一组的研究能够显示，用A型SchuS4的敲除菌株ΔclpB进行疫苗接种，对LVS和SchuS4感染具有强大的同源和异源保护，但对高剂量SchuS4的保护减弱。ΔclpB候选物显示出巨大的希望，潜在评估其他疫苗接种途径，如鼻内接种，可能在更高剂量下提供更好的保护。像ΔclpB突变体一样，弗朗西斯菌株的aro突变体也被探索作为活减毒疫苗候选物。具体来说，SchuS4的ΔaroD突变体在小鼠中显示出强大的保护，并诱导了细胞和体液免疫反应。另一项使用兔子作为模型而不是小鼠的研究显示，与ΔaroD相比，ΔclpB株的保护减少，并且O-抗原抗体的发展与保护相关，尽管似乎不同的模型可能对这些抗体有不同的要求。额外的研究表明，可能是ΔclpB感染的巨噬细胞产生的前列腺素E(2)正在改变免疫反应并导致更好的结果，这表明这可能是疫苗开发中的一个重要靶点。已经有多种尝试创建LVS和SchuS4的突变株以开发更好的疫苗候选物，其中一些在下面突出显示。关于这种合理疫苗方法的更多讨论可以在Marohn和Barry的综述中找到，详细描述了弗朗西斯菌的不同突变及其疫苗效力。最近，SchuS4突变体，ΔFTT0369c，或与ΔFTT1676结合的双突变体，也显示出对SchuS4的皮内或鼻内挑战具有很好的保护。其他团队已经探索了LVS的敲除或突变株，试图保护SchuS4。Jia等人创建了一个LVS的capB突变株，当与表达弗朗西斯菌免疫保护性抗原IgIC的重组李斯特菌菌株一起使用时，显示出75%的保护率对抗SchuS4的气溶胶挑战。其他LVS基因的突变，包括FTL_0291，FTL_0325和FTL_0057，已经被测试为鼻内疫苗，并显示出100%的保护率对抗鼻内挑战。这些突变株表明，使用A型或B型菌株的活减毒疫苗是有希望的，但关键是要确定正确的基因组合，以实现适当的免疫原性以获得保护。其他研究寻求使用F. novicida作为活减毒疫苗而不是LVS。F. novicida传统上不是人类病原体（只在严重免疫受损的情况下引起疾病），使其更安全地制造和管理。F. novicida在遗传上也比F. holarctica衍生的LVS更容易处理。使用活减毒F. novicida疫苗接种猕猴的研究显示，除了比接受LVS的动物产生更高的抗体滴度和IFNγ T细胞反应外，还对F. tularensis显示出肺部保护，突出了F. novicida可以作为一个新兔热病疫苗的平台。F. novicida与F. tularensis共享约97%的基因组，并且也能在小鼠中引起类似兔热病的疾病，这导致研究人员将其用作研究F. tularensis的小鼠感染模型的替代品。然而，尽管这些弗朗西斯菌种的基因组之间存在高度同源性，但已经显示出有足够的基因组和蛋白质功能差异，对使用F. novicida作为F. tularensis的替代品构成挑战。

为了同时引发体液和细胞反应，也开发并测试了灭活全细胞疫苗。这些疫苗具有吸引力，因为它们使宿主接触到病原体相关抗原的全部，而没有感染或恢复到更具毒性形式的风险。Foshay早期尝试使用甲醛灭活或热杀死细菌的结果产生了高度反应原性的配方。或者，用于灭活细菌的酚保存在猕猴中提供了一些对疾病的保护；然而，一些动物仍然发展出坏死性腿部病变和淋巴结病。最近，研究重新评估了灭活LVS，以评估不表现出Foshay原始配方中观察到的反应原性的配方。用对甲醛灭活的LVS加IL-12接种的动物在挑战活LVS时显示出增强的细菌清除、减少的组织炎症和增加的抗体反应；然而，动物没有用完全致病的F. tularensis挑战，因此不清楚这种准备是否能有效对抗最致病的亚种。配方中添加IL-12是必要的，可能部分原因是其能够推动IFNγ的产生和Th1细胞反应的激活。在BALB/c小鼠中，用免疫刺激复合物（ISCOMS）肌肉注射灭活LVS延长了中位死亡时间（MTD），但在低剂量肺部挑战F. tularensis时未能保护免于死亡。对甲醛灭活的LVS也与霍乱毒素B作为佐剂共同施用，并显示出100%的保护对抗鼻内挑战LVS和50%的保护对抗鼻内挑战F. tularensis株SchuS4。总的来说，这些发现表明，活减毒或灭活全细胞疫苗加上额外的佐剂可能是开发成功疫苗的有希望的平台，但目前的LVS菌株可能不是保护对抗A型F. tularensis感染的理想基础。

4.2.亚单位和结合疫苗

探索了针对F. tularensis感染的亚单位和结合疫苗方法。这些方法显示出不同的效力，但没有一种像上面讨论的活减毒疫苗那样成功。亚单位疫苗的开发通常依赖于识别能够引发体液和/或细胞免疫反应的保护性抗原。脂多糖（LPS）和像Tul4、FopA、DnaK、GroEL、KatG和SucB这样的蛋白质都被确定为F. tularensis感染后常见的疫苗靶标，但所有这些都未能在研究中引发对肺部F. tularensis的保护反应。这些亚单位疫苗都需要添加佐剂来引发强烈的免疫反应，并且在这些研究中评估了各种佐剂。为了优化弗朗西斯菌疫苗的效力，选择佐剂应该战略性地针对以引发强大的细胞介导的免疫反应。在几种亚单位方法中，使用了结合佐剂，可以允许适应性免疫反应的两个分支的诱导，或者单独的佐剂可以推动细胞介导的反应。这些方法中佐剂的选择是关键的，但真正决定保护的是佐剂/抗原对的组合。这些亚单位疫苗未能提供完全保护的能力可能是由于弗朗西斯菌中已知的免疫优势表位的缺乏，因此更难确定使用的最佳蛋白质或多糖组合。抗原的展示方式也可能在疫苗效力中起作用。例如，弗朗西斯菌已被证明在感染气道中的树突状细胞时会引起异常的促炎细胞因子的诱导，并且可以在感染后引起巨噬细胞上MHC的下调。这些发现强调单一表位或靶标可能不是最佳候选物，因为它们可能未能密切模仿感染期间所见的情况。以前的研究已经使用了来自F. tularensis外膜蛋白的肽段，这些肽段已知在感染后被CD4 T细胞识别。这些来自Tul4和FopA的合成肽段与佐剂CpG一起交付，除了抗原特异性IgG产生外，还推动了树突状细胞的成熟和炎症细胞因子的分泌。虽然这种配方没有经过F. tularensis挑战的测试，但它可能是有希望的，因为它引发了细胞和体液反应。

破伤风毒素与LVS的O抗原的LPS部分结合显示出对低剂量F. tularensis鼻内挑战的中等保护，并在BALB/c小鼠中显示出高抗体滴度。反应特定于配方中使用的O抗原的分子量，分子量较高的O抗原提供了更大的保护。O抗原也与牛血清白蛋白结合，用这种配方免疫的小鼠对LVS的皮内挑战受到保护，但对气溶胶LVS或F. tularensis没有保护。使用F. tularensis O抗原与P. aeruginosa外毒素A（ExoA）结合的糖结合疫苗诱导了高抗体滴度，并延长了LVS挑战后的平均死亡时间，大约一半的免疫小鼠在挑战后存活超过20天，比未免疫对照组长约15天。在随后的调查研究中，使用与相同糖结合疫苗和佐剂MF59结合的大鼠感染模型，显示出对低剂量F. tularensis肺部挑战的强大保护。研究表明，使用这种疫苗佐剂组合的免疫引发了脾细胞的IFNγ反应，这是由ExoA驱动的。Rawool等人试图通过使用F. tularensis LPS特异性IgG2a单克隆抗体结合的灭活F. tularensis直接针对APCs的疫苗候选物。这允许疫苗通过它们的Fc受体直接被APCs吸收，并显示出对LVS挑战的保护效力，但对致病的F. tularensis SchuS4只有中等保护。另一个有趣的可能性是直接针对APCs上的补体受体使用专门为此目的设计的工程疫苗菌株。这已经在针对巨噬细胞补体受体的弗朗西斯菌模型中显示出有效性，可以扩展到其他APCs。总的来说，这些研究显示出不同的效力，但表明需要弗朗西斯菌抗原和其他成分如佐剂的组合，以引发保护性细胞和体液免疫的适当平衡。

4.3.纳米颗粒疫苗

其他方法寻求将弗朗西斯菌蛋白结合到新型纳米颗粒递送系统中。一种方法使用了装载F. tularensis抗原的葡聚糖颗粒，与LVS衍生的LPS结合到颗粒表面。这种方法在C57Bl/6小鼠和Fisher 344大鼠中对F. tularensis SchuS4的气溶胶挑战诱导了保护，并减少了临床疾病严重性的迹象，然而他们没有识别出保护的相关因素。

使用类似的方法（将蛋白质与载体系统结合），OmpA、DnaK、Tul4 和 SucB 被耦联到烟草花叶病毒（TMV）表面，以创建四价颗粒疫苗配方。通过鼻内免疫接种这种蛋白质-TMV偶联物，可以在挑战后21天内对致死剂量的LVS提供100%的保护，并且在挑战后163天内提供80%的保护。这种配方还能在84天后产生回忆性IFNγ反应，以及模拟从感染挑战中产生的IgG滴度的抗体。这项研究代表了对弗朗西斯杆菌疫苗的一种有希望的方法。虽然只评估了对LVS的保护，但对脾细胞的回忆反应也针对致病性弗朗西斯杆菌进行了测量，仍然显示出高产量的IFNγ。另一种方法使用了自组装纳米结构：带有弗朗西斯杆菌全细胞裂解物的猫离子表面活性剂囊泡。这些囊泡，辅以单磷脂A（MPL-A），显示出对LVS的完全保护和对弗朗西斯杆菌SchuS4的适度保护。强调虽然这种配方强烈增加了抗体反应，但T细胞反应并未得到很好的表征，这可能是理解和创建针对弗朗西斯杆菌SchuS4的强大保护性疫苗的关键。

细菌外膜囊泡（OMVs）是纳米颗粒中独特的一个子集，因为它们是从革兰氏阴性细菌自然脱落的，因此可以模拟活细菌。OMVs正在作为纳米颗粒疫苗在多种环境中被探索，包括FDA批准的脑膜炎球菌B群疾病疫苗，Bexsero。其他研究表明，相同的OMVs既可以作为疫苗也可以作为佐剂，因此可能表现为自佐剂抗原递送系统。与弗朗西斯杆菌密切相关的F. novicida的OMVs可能是对抗兔热病的一种新型疫苗方法。虽然已知F. novicida OMVs对同源F. novicida感染有保护作用，但需要进行研究以评估这种添加是否会激发对F. tularensis的保护。OMV疫苗方法因弗朗西斯杆菌本身不产生足够数量的OMVs作为疫苗而变得复杂。因此，另一种可能的方法是使用表达或与F. tularensis已知保护性抗原偶联的F. novicida OMVs，从而将OMVs的内在佐剂性和免疫刺激方面与提供针对F. tularensis感染保护的最有望的抗原结合起来。

纳米颗粒作为递送系统或佐剂越来越受欢迎，特别是考虑到Pfizer和Moderna SARS-CoV-2 mRNA疫苗的成功，这些疫苗被包裹在脂质纳米颗粒中。对于基于核酸的疫苗，如mRNA疫苗，这种递送系统在将抗原递送到正确的宿主区域以实现保护性免疫方面至关重要。纳米颗粒本身由于其大小和组成而显示出内在的佐剂性，这也将使使用它们的配方从中受益。在考虑针对弗朗西斯杆菌等细胞内细菌的疫苗开发时，使用能够将目标抗原送入宿主细胞的基于纳米颗粒的系统也可能是合理的，它们可能会在模拟自然感染的情况下遇到免疫反应。

5.结论和未来疫苗工作

在过去的十年中，关于弗朗西斯杆菌感染的免疫和针对各种感染途径的疫苗保护相关性的知识有所增加。尽管如此，这些进展尚未产生FDA批准的用于军事或民用人群的人类疫苗。这里强调的一些候选疫苗在临床前显示出希望，但只有一个进入了临床试验，并且尚未在全球范围内获得人类批准。包括减毒活疫苗、亚单位疫苗和结合疫苗在内的传统方法都已尝试过，并且取得了不同程度的成功。这可能是因为新的疫苗配方未能激发类似于感染的免疫反应，或者是它们无法同时激发先天和适应性免疫系统。最近的一项研究表明，根据感染途径的不同，F. tularensis具有不同的特定代谢生态位。这可能意味着没有单一的疫苗接种方法可以对抗F. tularensis，拥有多种类型的疫苗以对抗不同感染途径是理想的。一些较新的疫苗方法包括佐剂以刺激免疫反应，通常与非佐剂组相比取得了更好的结果。添加适当的佐剂可能是解锁成功疫苗方法的关键。佐剂以多种方式增强免疫系统，并作为沉积物、模式识别受体激活剂，同时具有激活炎症体的能力。对弗朗西斯杆菌的保护性免疫需要T细胞，B细胞的作用不太明确；先天反应也有助于免疫，导致细胞因子的产生，最终控制细胞内复制。针对弗朗西斯杆菌的疫苗接种应考虑所有这些因素，并以适当的方式、适当的抗原和佐剂组合激发免疫系统。新的、未经测试的佐剂可能对F. tularensis感染的保护性免疫有强大的影响。特别是在能够针对粘膜组织并产生适当免疫反应的佐剂的情况下。例如，已知ADP-核糖基化佐剂双突变热不稳定毒素（dmLT）可以推动抗原特异性T细胞和B细胞进入肺和肠道等粘膜组织。即使dmLT佐剂疫苗通过非粘膜途径递送也是如此。此外，包括dmLT在内的各种新型佐剂可以直接通过粘膜途径递送，已知粘膜疫苗接种可以在递送部位诱导强大的组织驻留免疫，因此这可能是另一种保护免受肺部感染的策略。也可能通过结合不同的佐剂来产生更强大的免疫反应，这种反应涉及先天免疫系统，随后诱导协同增加的细胞免疫。这已经在dmLT与脂多糖衍生的单磷脂A联合使用的佐剂中得到证明，它们激活非焦亡炎症体，增加抗原特异性CD4 T细胞的数量，超过任何单一佐剂单独预期的效果。

显然，需要针对F. tularensis的新疫苗方法，特别是对于通过呼吸道获得的感染。这些策略可能需要结合新型佐剂和配方，如纳米颗粒递送系统。其他策略可能是使用替代的粘膜疫苗接种途径，如鼻内或口服吸入喷雾疫苗，直接针对肺部免疫。将临床前动物模型与可以导致临床试验的新型疫苗方法结合起来，是开发能够保护免受感染的兔热病疫苗的关键下一步，也是针对这种致命细菌病原体的疫苗开发计划的下一步。

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