探秘RNA编辑技术CRISPR-Cas13及应用最新进展

文摘科学 2023-03-30 09:41 北京

导言

CRISPR-Cas基因编辑技术正式诞生至今已经11个年头了[1]，仅仅11年时间CRISPR-Cas就风靡了生命科学领域的各个角落，迅速走出实验室、走向产业界，开启了商业化进程。CRISPR-Cas基因编辑技术在2020年获得诺贝尔奖化学奖，可见这项技术的强大。

CRISPR-Cas起源于细菌中抵御外源病毒和质粒DNA入侵的获得性免疫机制系统。它能够识别外来病毒携带的核酸序列，并且切断这些核酸序列，达到抑制病毒繁殖的效果。CRISPR-Cas系统可分为两个大类，总计6个亚型。其中最令人瞩目的是第二个大类里的Cas9（II型）、Cas12（V型）和Cas13（VI型），他们具有设计和使用简单、特异性强、可编程、效率高等优点。CRISPR-Cas9是发现最早、商业化进程最快、也是最为熟知的技术，不过它也存在着只能靶向DNA、蛋白体积过大、脱靶效应等方面的不足。同时，CRISPR-Cas9专利保护非常全面，涉足该领域的企业很难有绕过相关专利的空间。

本文将要介绍的CRISPR-Cas13是唯一靶向RNA的CRISPR-Cas系统，极大地补充和拓展了该系统的应用范围，有着广阔的开发前景。同时由于CRISPR-Cas13发现相对较晚，专利覆盖范围较CRISPR-Cas9相对较窄。

01 CRISPR-Cas13介绍

CRISPR-Cas13相关研究起源于2015年MIT华人科学家张锋在Molecular Cell上发表的一篇报道[2]，其后续相关报告中继续阐明了Cas13a（C2c2）具有切割RNA功能，正式揭开了CRISPR-Cas13系统研究和应用序幕。

CRISPR-Cas13系统是由单一的效应蛋白Cas13和crRNA组装形成复合物，Cas13蛋白在crRNA的引导下可以靶向与crRNA互补配对的序列，并进一步切割靶序列。由于不少疾病的根源在于RNA，而CRISPR-Cas13能够高通量地实现对RNA的编辑与调控，因而能在更广泛层面上实现对于基因功能的调节，对于疾病的研究与治疗具有深远的意义。

图1 Cas13蛋白种类及其大小

数据来源：Hui Yang, 2021[3]

截至目前，共发现有6种效应蛋白属于这个家族，即Cas13a（C2c2）、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas13X和Cas13Y。这6种Cas13亚型蛋白均小于Cas9蛋白，因此CRISPR-Cas13更容易被承载于载体中，开发其临床应用。Cas13a（C2c2）是发现最早的效应蛋白。Cas13X和Cas13Y是最新发现的效应蛋白，其中Cas13X是目前报道最小的RNA编辑工具，更容易利用腺相关病毒（AAV）载体实现体内递送，在临床应用方面具有广大的前景。Cas13d是另一种体积较小的蛋白，可以用AAV载体进行包装，Cas13d蛋白介导的RNA敲除效果相对于其他方法具有更高的效率和特异性。

值得注意的是，当CRISPR-Cas13系统识别底物RNA后，Cas13蛋白被激活，对底物RNA进行特异性地切割的同时，还会非特异性地切割游离在环境内的单链RNA，这种现象被称为旁系切割（collateral cleavage）。旁系切割的存在，使得CRISPR-Cas13系统可以用于构建新型的检测试剂来实现目标基因的检测，但也对CRISPR-Cas13在临床上的应用带来了一定阻碍，应用于人类疾病的新型疗法都在设法减少乃至消除旁系切割效应。

02 CRISPR-Cas13应用-诊断与检测

在诊断领域，相比于基于Cas9系统的诊断试剂检测耗时长且需要变温反应，Cas13蛋白因组成简单、无需变温且检测快速，而更具优势。基于CRISPR-Cas13系统的检测技术可以实现对病毒感染、细菌感染及癌症相关突变基因、耐药基因等方面的全面检测。

旁系切割这一现象的存在，是CRISPR/Cas13系统作为诊断技术的基础。例如MIT张锋团队开发的SHERLOCK[4]，在反应体系中加入带有荧光基团的报告分子，该分子一端连有荧光基团，另一端连有猝灭基团，正常情况下报告分子不发出荧光。当Cas13蛋白识别到目标核酸时，由于旁系切割的特性，环境中带有猝灭基团的报告分子同时被非特异性切割，从而释放荧光。与传统的核酸检测金标准qPCR相比，SHERLOCK检测速度更快且对设备的依赖性更低。SHERLOCK已被用于检测新冠病原体SARS-CoV-2，以该技术为基础开发的新冠检测产品在2020年5月获得了新冠检测EUA，成为全球第一个注册获批的CRISPR诊断试剂。后续还推出了改进版本的SHERLOCK V2，进一步提高了检测的灵敏度，并引入纸基传感器，使检测结果可以直接用肉眼进行判断。

图2 SHERLOCK工作原理

数据来源：Feng Zhang, 2017[4]

世界上许多最常见或致命的病原体，如埃博拉病毒、寨卡病毒、艾滋病病毒、流感病毒等都是RNA病毒，新冠病原体SARS-CoV-2同样是RNA病毒，CRISPR-Cas13针对RNA的特性能很好实现对这类病毒的检测。基于SHERLOCK技术还开发了一种名为CARMEN的新型诊断微流控芯片，单一芯片一次可以针对一种病毒检测1000多个患者，或针对一个患者一次对多达169种病毒（包括新冠病原体SARS-CoV-2、全亚型的A型流感病毒株、数十种HIV耐药性突变病毒株）进行检测。CARMEN从提取RNA到取得结果约需8个小时，高通量的检测能力使其在公共卫生领域具有很大的应用潜力。

Sherlock Biosciences是张锋教授在2019年创建的公司，专注开发速度更快、效果更好、价格更低的新型诊断/检测技术，用于多种不同的领域。该公司核心技术分别是基于基因编辑技术CRISPR/Cas13的诊断技术平台SHERLOCK™和基于合成生物学的分子诊断平台INSPECTR™。2022年3月，Sherlock Biosciences完成最新的B轮融资，价值8000万美元。

图3 Sherlock Biosciences

数据来源：公司官网信息

02 CRISPR-Cas13应用-新型疗法

（1）抗病毒

将CRISPR-Cas13的抗病毒活性与其诊断能力结合起来，研究者构建了一种名为CARVER的抗病毒系统，可以检测和消灭人类细胞中基于RNA的病毒。这是在体外培养的人细胞中，首批利用CRISPR系统作为抗病毒剂的研究[5]。基于CRISPR-Cas13系统的CARVER具有在未来用于诊断和治疗病毒感染的潜力。

目前有许多病毒没有FDA获批疗法或者疫苗，而许多常见或致命的病原体属于RNA病毒，因此基于CRISPR-Cas13的抗病毒疗法具有诱人的前景。同时，CRISPR-Cas13系统通过靶向RNA的核酸酶切活性破坏病毒基因组的方式，不易导致病毒产生对抗病毒药物的耐药性。将它开发为治疗手段，需要解决的关键问题是如何将CRISPR/Cas13系统安全有效地递送到细胞内去消灭病毒。随着递送技术的不断进步，开发可编程的基于CRISPR-Cas13的抗病毒疗法能够早日成为现实。

Carver Biosciences是由普林斯顿大学Cameron Myhrvold教授于2021年创建的专注于开发CRISPR/Cas13抗病毒药物的生物技术公司。其设想是利用CRISPR/Cas13，开发靶向切碎病毒RNA序列的新疗法。该疗法力图提供一种可编程的抗病毒疗法开发平台，只要改变gRNA序列就可以用于治疗不同的病毒类型，并且可以迅速对新出现的病毒做出反应。2022年9月，Carver Biosciences宣布完成种子轮融资。

图4 Carver Biosciences

数据来源：公司官网信息

（2）单碱基突变疾病治疗

除了使用具有活性的Cas13来对RNA分子进行编辑外，还可以通过突变获得失活的Cas13蛋白（dCas13）。dCas13蛋白虽然失去了切割酶活性，但仍保留靶向目标RNA的结合酶活性，将其与其他功能蛋白结合可以实现靶向目标RNA的特定功能。

许多遗传疾病是由单碱基突变引起的，如早衰症和苯丙酮尿症等。研究者通过将失去剪切活性的dCas13蛋白与脱氨酶ADAR2融合，并解除ADAR2的底物偏好性，开发出能够实现碱基水平的基因编辑RESCUE系统，其能够对特定的碱基脱氨，具有将碱基A转化为碱基I以及将碱基C转化为碱基U的能力[6]。这一类基于CRISPR-Cas13系统的碱基编辑器，具有治疗单碱基突变疾病的潜力。

Beam Therapeutics是由张锋教授、刘如谦教授于2017年创建的首个利用CRISPR-Cas单碱基编辑技术开发新型药物的公司，其核心技术是能精准地对RNA或DNA上的单个碱基进行编辑。此外还拥有基于CRISPR-Cas的基因编辑技术，以及电穿孔法、LNP、AAV的不同的药物递送模式。2020年2月，Beam Therapeutics在纳斯达克成功上市，共筹集1.8亿美元资金。

图5 Beam Therapeutics

数据来源：公司官网信息

（3） RNA敲低治疗疾病

将Cas13效应蛋白导入靶细胞或组织后切割目标RNA使其失去功能，有可能用于实现相关疾病的治疗。所有RNAi、ASO药物靶点都可能是CRISPR-Cas13进行RNA敲低治疗疾病的潜在靶点。例如，CRISPR-Cas13高灵敏性且选择性地敲除突变的癌基因相关的RNA，从而特异性地作用于癌细胞。利用Cas13效应蛋白也可以同时敲除与特定疾病相关的一组RNA，比如通过敲除与代谢调节相关的RNA而达到研究或治疗糖尿病的目的。

Arbor Biotechnologies是由张锋教授在2016年创建的生物医药公司，致力于通过基因编辑技术治疗人类疾病。自成立以来，其建立了行业内最全面的包括CRISPR-Cas13在内的基因组编辑工具。该公司除了专注于肝脏和中枢神经系统的基因药物研发以外，还与其他公司合作开展了多项基因编辑和体外细胞治疗项目，以扩大其CRISPR-Cas的应用范围。2021年11月，Arbor Biotechnologies完成最新的B轮融资，价值2.15亿美元。

图6 Arbor Biotechnologies

数据来源：公司官网信息

辉大基因是在2018年由中科院神经所的杨辉研究员创建的专注于基因治疗药物开发的公司。辉大基因拥有基因编辑、AAV、疾病模型动物和工艺转化及生产在内的四大技术平台。辉大基因以自主研发的CRISPR-Cas13基因编辑工具为核心，目前的研发管线包括神经退行性疾病、视觉障碍、听力障碍等领域。为2022年5月，辉大基因完成最新的C轮融资，价值数亿元人民币。

图7 辉大基因

数据来源：公司官网信息

实际上CRISPR-Cas13系统在临床应用上的一大阻碍是Cas13蛋白对非靶点RNA的旁切活性，已有证据表明旁切活性会对动物细胞和个体产生一定毒副作用。同时，将这类基因编辑技术应用于临床必须要从效率、脱靶、递送载体三个方面进行优化，体内编辑效率的进一步提高、旁切活性的降低乃至消除。因此，只有递送技术的进一步发展才能使CRISPR-Cas13技术早日应用于临床。

03 总结与展望

CRISPR-Cas13作为唯一靶向RNA的CRISPR-Cas系统，有着独特的安全性优势和应用范围，未来发展潜力巨大，应用空间十分广阔。目前该技术最成熟的应用场景为诊断与检测领域，此外，在抗病毒、单碱基突变疾病治疗、RNA敲低等新型疗法方面已产生了许多激动人心的研究进展，出现了一批踌躇满志的初创企业。相信未来随着递送载体的进一步优化和旁切活性的降低，以及基因编辑效率和选择性的进一步提高，CRISPR-Cas13将有望改变众多疾病的诊疗现状。

参考文献

[1] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. science, 2012, 337(6096): 816-821.

[2] Shmakov S, Abudayyeh O O, Makarova K S, et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems[J]. Molecular cell, 2015, 60(3): 385-397.

[3] Xu C, Zhou Y, Xiao Q, et al. Programmable RNA editing with compact CRISPR–Cas13 systems from uncultivated microbes[J]. Nature methods, 2021, 18(5): 499-506.

[4] Gootenberg J S, Abudayyeh O O, Lee J W, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[J]. Science, 2017, 356(6336): 438-442.

[5] Freije C A, Myhrvold C, Boehm C K, et al. Programmable inhibition and detection of RNA viruses using Cas13[J]. Molecular cell, 2019, 76(5): 826-837. e11.

[6] Abudayyeh O O, Gootenberg J S, Franklin B, et al. A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing[J]. Science, 2019, 365(6451): 382-386.

作者：苏福宝、吴莎莎

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