“经典”与“创新”似乎是一对难以共存的反义词，特别是对于明星基因，我们申报项目的时候常会因为评审专家的一句“A基因在某疾病中已有报道，因此创新性一般”而苦恼，但是如果一个分子完全没有报道，参考文献又很少，因此创新与经典之间的平衡或者取舍就成了大家关心的问题。
今天我们通过一个非常“老”的分子来看一下研究如何做出新意。文章标题：Nuclear PKM2 binds pre-mRNA at folded G-quadruplexes and reveals their gene regulatory role.
研究由美国马里兰州贝塞斯达RNA分子生物学实验室Markus Hafner团队近期发表在Molecular cell（Q1，14.5）上，关注的“明星分子”是大名鼎鼎的PKM2。
编者按
PKM2是糖酵解过程中的关键酶，先前研究主要围绕PKM2通过糖酵解调控肿瘤细胞增殖、转移以及免疫微环境中免疫细胞与基质细胞（如成纤维细胞）的影响开展，也有很多相关的中标项目：
l PDGFRβ介导PKM2的O-GlcNAc糖基化修饰诱导CAFs代谢重编程促进三阴乳腺癌紫杉醇耐药的机制和临床转化研究
l FUT8响应乳酸应激调控PKM2乳酸化修饰促进肾透明细胞癌恶性进展的机制研究
l 肝积方调控FOXO1/PPARγ促进PKM2介导的TAMs糖酵解重编程抗肝癌的机制研究
l RLIM通过双途径促进PKM2介导的糖酵解在胰腺癌血管生成中的作用研究及其分子影像的可视化评价
也就是说：不管研究围绕的是肿瘤细胞、免疫细胞，甚至不是肿瘤疾病，PKM2的经典作用都是代谢酶，因此“代谢”就是PKM2的经典标签。那么问题来了：研究团队是如何从非经典途径入手，对糖酵解酶PKM2进行花样创新的呢？
一、主要研究内容与亮点
研究团队发现核定位（PKM2发挥代谢酶活性的时候主要定位于胞浆）的代谢酶PKM2（nPKM2，注1）作为一种非典型RNA结合蛋白（RBP），提示其发挥转录调控作用；在具体机制上，核PKM2与前体 mRNA (pre-mRNA)上的RNA G-四链体(rG4)（注2）结合，解除HNRNP与rG4对EMT的转录抑制作用，导致EMT活化并促进肿瘤增殖转移。
因此研究的作用信号轴为：核PKM2与pre-mRNA上的折叠G-四链体结合，调控rG4ome（细胞内所有含有RNA G-四链体结构的RNA分子的集合）的表达，影响肿瘤细胞的迁移和侵袭。
机制示意图
注1：核定位的蛋白还可能具有直接结合DNA，发挥类似转录因子的转录调控机制，本研究中虽然PKM2还是发挥转录调控作用，但研究是依赖于RNA G-四链体(rG4)的。如2023年Cell Discovery期刊上的研究就发现核定位PDL1（nPDL1）可直接调控EGR1的转录活性：
注2：RNA G-四链体是由富含鸟嘌呤（Guanine, G）的RNA序列通过特定的堆叠和折叠形成的高级结构，它们在基因表达调控、DNA复制、RNA加工和稳定性等方面发挥重要作用。在本研究中，rG4ome特指那些含有RNA G-四链体结构的前mRNA（pre-mRNA），这些结构与特定蛋白质（如PKM2）的结合可以调控它们的表达。相关基金主要围绕DNA G4，而RNA G4的研究还比较新，如整合固态纳米孔和生物膜纳米测序技术研究活体细胞RNA G-四链体形成及RNA-G4解旋酶的分子机理（方法学）。
二、本研究中的关键科学问题
研究团队首先通过RNA Bind-n-seq (RBNS)实验筛选PKM2的RNA结合特性，然后利用电泳迁移率变化分析（EMSA）验证PKM2与G4结构的结合；
接着，通过荧光光活化核糖核苷酸增强交联和免疫沉淀（fPAR-CLIP）技术，研究人员绘制了PKM2和HNRNPF在细胞核内的RNA结合图谱，并分析了它们对rG4形成序列（PRG4S）的结合情况。
此外，通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，研究团队在MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞中排除了PKM2的核定位，并观察了这一变化对肿瘤生长和转移的影响。
三、课题论证逻辑：
研究团队首先通过实验，证实了PKM2可以特异性地结合前体mRNA中的rG4结构，并揭示了这一结合对于阻止抑制性RNA结合蛋白如HNRNPF的作用具有重要意义。
接着，通过细胞模型和小鼠异种移植模型，研究了PKM2与rG4相互作用对基因表达和癌细胞侵袭行为的影响，并进一步通过基因编辑技术来减少核内PKM2的积累，以探索其在肿瘤进展中的具体作用机制。
最后，使用RNA测序和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术，系统性分析了rG4在基因调控中的作用，并验证了PKM2-rG4相互作用的生物学功能。
四、本研究局限性
在操纵核PKM2水平时，RNA-seq和 ChIP-seq中观察到的差异不完全一致；另外，虽然TCGA中rG4ome水平与各种癌症患者预后不良具有相关性，但还需要进一步的统计分析和实验证据。
五、本类研究的总结
本研究的创新点在于对经典蛋白PKM2的非经典机制进行了探究，即作为转录调控的元件发挥作用。关于转录调控研究的“通用”实验步骤与技术大致如下：
1，体外实验：应用RNA Bind-n-seq (RBNS) 对细胞进行检测，通过新一代测序进行定量分析，并使用电泳迁移率分析 (EMSA)技术以确定目标蛋白与RNA的结合；调控目的蛋白表达，使用RNA测序技术检测mRNA水平的变化，使用免疫沉淀实验确认蛋白与mRNA结合的具体种类、位点；
2，体内实验：使用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建小鼠模型，在动物层面探究蛋白表达与mRNA结合对移植瘤生长的影响；
3，临床意义拓展：结合TCGA等大型数据库进行数据分析，分析某蛋白-mRNA结合水平与患者预后的关联。
END
